scRNA-seq揭示胰腺导管腺癌的瘤内异质性和恶性进展

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文章信息
今天的这篇文章是2019年7月发表在Cell Research上的文章，题为Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma.

总 · 览

胰腺导管腺癌（PDAC）是最常见的胰腺癌类型，具有明显的肿瘤内异质性和不良预后的特点。作者采用单细胞RNA-seq技术从原发性PDAC肿瘤和对照胰腺中一共获得了57530（41,986 cells from PDAC and 15,544 cells from control pancreases）个细胞转录组图谱，全面描述了PDAC肿瘤内异质性和PDAC进展的潜在机制。在PDAC中，存在多种恶性和基质细胞类型，包括分别具有异常和恶性基因表达谱的两种导管亚型。作者发现异源恶性亚型由几群具有不同增殖和迁移潜能的亚群组成。细胞轨迹分析显示多个肿瘤相关途径和转录因子（TF）的组分沿PDAC进展差异性表达。此外，作者还发现具有独特增殖特征的导管细胞亚群与肿瘤浸润性T细胞的失活状态相关。总之，该研究结果为破译PDAC中的肿瘤内异质性提供了宝贵的资源。

样本 

24个原发性PDAC肿瘤病人样本及11个对照胰腺样本（3例非胰腺肿瘤患者和8例非恶性胰腺肿瘤患者样本）

建库及测序 

  • 10x Genomics 3’单细胞转录组测序试剂盒(V2 chemistry)

  • Illumina HiSeqXTen  instruments using 150 nt paired-end sequencing

数据处理主要步骤

  • 使用Cell Ranger 2.1.0流程，用默认和推荐参数处理数据；

  • 使用STAR算法将Illumina测序输出产生的FASTQ与人参考基因组（hg19）进行比对；

  • 通过计算独特的分子标识符（UMI）并过滤非细胞相关信息，生成表达矩阵；

  • 将表达矩阵导入Seurat（v2.3.0）R工具包，做质量控制和下游分析。

主要结果 

单细胞表达图谱与细胞分型

质控之后，从PDAC样本中获得41986个细胞，从对照胰腺组织样本中获得15544个细胞的转录组信息，进行主成分分析后鉴定得到了10个主要的群，包括1型导管，2型导管，腺泡，内分泌，内皮，成纤维细胞，星状细胞，巨噬细胞，T细胞和B细胞。接着用细胞群特有的marker基因进行细胞类型的识别。

CNV（拷贝数变异）数据区分PDAC中的恶性导管细胞

作者为了探究PDAC中存在的两种不同类型的导管细胞的恶性状态，基于跨基因组间隔的平均表达模式计算了每种细胞类型中的大规模染色体拷贝数变异（CNV）情况，发现2型导管细胞显示出比1型导管细胞及其他细胞更高的CNV水平。

作者接下来分析了PDAC中两种类型导管细胞的基因表达模式，并鉴定到了3107个差异表达的基因。功能富集分析显示，2型细胞中上调的基因主要富集癌症相关功能，如细胞增殖，迁移和缺氧，进一步支持该亚型的恶性状态。相反，1型中表达水平高于2型细胞的基因与正常胰腺功能相关，包括消化，胰腺分泌和碳酸氢盐转运，支持1型细胞仍然是一定程度的正常导管细胞。作者还鉴定到了多种标志物，例如AMBP和MUC1，可用于区分导管细胞的异常和恶性基因表达谱。然后，作者对PDAC和对照样品中的标记物进行免疫组织化学（IHC）染色以验证这2种类型的导管细胞，观察到AMBP阳性细胞主要存在于具有正常细胞特征的导管结构中。相反，MUC1或FXYD3阳性细胞显示典型的肿瘤细胞特征，并且在对照样品中不存在。总之，这些结果表明2型导管细胞是PDAC中恶性细胞的主要来源。

恶性导管细胞中的不同亚群

基于t-SNE分析，作者将2型导管细胞进一步分成7个亚群。作者发现亚群3是在PDAC患者中共有。相反，亚组1,2,4,5和6仅在一些患者中观察到，这反映了个体患者的肿瘤异质性。此外，作者还注意到第7组细胞在导管2恶性细胞中的比例较低。由于发现增殖是PDAC的主要特征，作者对每个亚组进行功能富集分析，发现第7组的独特功能与细胞周期和细胞增殖有关。

基于恶性导管标志物的TCGA PAAD样本数据的基因表达模式分析

作者接下来分析了来自TCGA的公共侵袭性胰腺导管腺癌及其变异（PAAD）数据，包括癌症表达数据，临床信息和基因组突变数据，以研究恶性导管细胞中基因表达模式的临床价值。共使用178个PAAD样品（146个PDAC样品，32个非PDAC PAAD样品）进行分析。使用恶性导管细胞标记物聚集PAAD肿瘤样品。结果表明，基于这些标质物，可以将所有样品分配至三个PDAC组（细胞群1-3）和一个非PDAC组（细胞群4）。作者注意到增殖性导管标记物与其他标记物明显分开。增殖性导管标记物在细胞群2和3中是丰富的。相反，细胞群4中的患者显示出这些导管标记物的表达水平有限。

具有高丰度增殖性导管标志物的PDAC患者中T细胞失活

作者使用TCGA数据分析了PDAC基质内的T细胞活化状态，观察到增殖性导管标志物表达量高时T细胞标志物表达量低。此外，在PDAC单细胞测序数据中也检测到这种反比关系。作者用免疫染色实验证实了该结论。

总结 

PDAC的特征在于高度的肿瘤内异质性，这是有效治疗PDAC的主要障碍。因此，非常需要探索肿瘤内异质性和对PDAC预后改善至关重要的潜在机制。在这项研究中，作者建立了各种细胞类型在PDAC中综合基因表达图谱，并基于scRNA-seq分析表征了每种细胞类型中基因表达谱的特征。这些发现不仅有助于推进目前对与PDAC进展相关的关键遗传网络的理解，而且有助于推进PDAC预后的转化应用。

文章还提到单细胞RNA测序技术中使用的10xGenomics基因组学具有一些局限性，例如仅测序3'末端和相对低覆盖度。尽管存在这些缺点，但与其他超高通量单细胞RNA-seq（如inDrop）相比，10×Genomics Chromium已被评估为在几个方面表现出最佳性能，包括分子灵敏度，精密度和最低技术噪音。

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