RNA甲基化修饰
最近关于m6A甲基化的研究，热度持续不减。早在2015年就已经在《Nature》和《Cell》上发表了相关研究。那么下面我们就来了解一下这期的主角——m6A甲基化。
已知RNA存在超过100种修饰。在真核生物中，5’端的Cap以及3’的ployA修饰在转录调控中起到了十分重要的作用，而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。mRNA最常见的内部修饰包括N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。对于大热的m6A，截至2017年，全球的科学家已经鉴定了参与m6A的许多酶，包括去甲基化酶、甲基化酶和甲基化识别酶等。芝加哥大学的何川教授对此贡献巨大。来自中科院北京基因组研究所的杨运桂研究员也是这方面的大牛。
一旦参与m6A修饰的酶出现异常将会引起一系列疾病，包括肿瘤、神经性疾病、胚胎发育迟缓等。此外，一些非编码RNA如lncRNA、tRNA、rRNA以及剪切体RNA在转录前后，也存在大量的碱基修饰活动。虽然近几年，关于RNA修饰的研究数量开始增多并慢慢成形，一些深入性的机制研究仍有大量的工作待全球的科学家去完成。但是无论如何，coding RNAs和non-coding RNAs上发生的动态修饰代表了一种全新的遗传信息调控方式。
早在上世纪60年代，除了传统的ACGU四种碱基外，Cohn等人已经在RNA上发现了大量的碱基位点修饰。Holley等人于1965年，首次在酵母的tRNA中鉴定了包括假尿苷（pseudouridine）在内的十余种不同的RNA修饰。已知绝大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap处存在甲基化修饰，作用包括维持mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻译起始等。而3’ polyA发生的修饰有助于出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白一起维持mRNA的结构稳定。
图1 真核生物mRNA上存在的各种碱基修饰行为，在5’和3’的UTR以及中间的coding region都有碱基发生修饰。
Roundtree et al (2017) Cell, 169 [15]: 1187-1200
但是这些修饰只发生mRNA的头部和尾部，关于RNA的内部修饰（internal modification）在许多种类的RNA中都有发生。无论是mRNA还是lncRNA，都大量存在m6A修饰。m6A能够加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞中的转运速度和出核速度。除了m6A，RNA上还存在以下常见的几种修饰，包括m1A，m5C等（图1）。
已知tRNA上发生碱基修饰的比例较高，会有各种各样的碱基修饰行为。tRNA修饰有助于提高翻译效率，维持其三叶草折叠二级结构的稳定性。人类的核糖体RNA（rRNA）上有超过200个碱基修饰位点，而剪切体RNA（spliceosomal RNA）上也有超过50个碱基修饰位点。
虽然RNA甲基化的研究在上世纪七十年代就开始，但是由于技术上的局限一直停滞不前。直到最近几年在何川教授等研究团队的带领下，通过不断的技术创新和难点攻克，m6A 等甲基化修饰的研究才不断取得突破性的进展。
随着分析化学工具的升级以及高通量测序技术的兴起，研究RNA修饰的方法变得越来越便捷。强大的工具是研究工作的前提保证。伴随NGS的发展，表观转录组学诞生了，其中大热的主角就是腺苷酸甲基化，包括m6A和m1A等。那么下面我们就要来讲一讲这期的主角m6A。
图2 N6-甲基化腺苷酸结构示意图 Roundtree et al (2017) Cell, 169 [15]: 1187-1200
我们先来了解下什么叫m6A修饰。从图2中我们可以看到，这是一个已经发生甲基化的核糖核苷酸，确切地说叫N6-methyladenosine。一共分为2个大的结构。我们先来回顾下基础生物化学知识。左下角的是五碳糖，图2中a框部分也就是五碳糖的第二位C处的羟基发生脱氧就会变成脱氧核糖核苷酸（从RNA变成DNA）。图2中c框部分标注的，也就是第四位的C处通常会带有磷酸基，如果此处带有2个磷酸基团那么就叫ADP，如果带有3个磷酸基团那就是大名鼎鼎的ATP了。图2中b框部分通常就是我们所说的含氮碱基。这里特指腺苷酸（A），当腺苷酸的第六位N处发生甲基化时，就是我们所说的m6A。
图3 （左）腺苷酸甲基化和去甲基化的过程（Roundtree et al (2017) Cell, 169: 1187）；
（右） m6A甲基化酶consensus motif（Fu, Y et al (2014) Nature Reviews Genetics, 15(5): 293）
从图3左中我们可以看到，当从DNA→RNA过程中，腺苷酸在甲基化酶METTL3、METTL14和WTAP等作用下在第六位N发生了甲基化修饰。这类酶我们称之为Writers，其中METTL3和METTL14形成杂络物（hetero complex），与WTAP（也叫做Fl(2)d）及其他factors如KIAA1429（也叫做Virilizer）一起对腺苷酸进行修饰。另外Writers酶还包括酿酒酵母中的Ime4等。
接下来这些已经发生m6A修饰的碱基，在FTO和ALKBH这两种酶的作用下发生去甲基化。其中FTO就是臭名昭著的Fat mass and obesity-associated protein，其详细的分子机制在2007年的小鼠模型上做过比较系统的研究。该酶与ALKBH5一起，使得RNA甲基化成为一种可逆的反应。
最后这些发生甲基化修饰的RNA碱基位点，需要特定的酶来识别。这时候就需要咱们的readers登场了。已知YTHDF家族包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3以及酿酒酵母中的Mrb1基因、粟酒裂殖酵母中的Mmi1基因都是readers类蛋白。这些酶能够识别发生m6A甲基化的碱基，参与下游翻译、mRNA降解、加快mRNA出核速度等作用。如图4C中所示，YTHDF2参与mRNA降解过程。
图4 m6A分子途径和细胞功能（Mihye Lee et al (2014) Cell, 158: 980）
好了，让我们再来系统地回顾一下，参加m6A甲基化的酶到底有哪几类。从图4B中，我们可以看到RNA的m6A甲基化一共有大三类酶参与：Writers、Erasers和Readers，具体信息如下表所示。
今天的RNA甲基化小课堂就讲到这里了，下一期我们会讲一讲如何检测RNA甲基化，尤其是使用高通量测序的手段检测m6A这种类型的RNA甲基化修饰。敬请期待RNA甲基化修饰（2）——如何检测m6A。
参考文献
1. Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C*. "Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation." Nature Reviews Genetics 15.5 (2014):293-306.
2. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C*. "Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation." Cell 169.7 (2017):1187.
3. Cantara, William A., et al. "The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update." Nucleic Acids Research 39.Database issue(2011):D195.
4. Lee, M., B. Kim, & A. V. N. Kim*. "Review: Emerging Roles of RNA Modification: m6A and U-Tail." Cell 158.5 (2014):980.
5. Cohn, W. E*. "Pseudouridine, a carbon-carbon linked ribonucleoside in ribonucleic acids: isolation, structure, and chemical characteristics." Journal of Biological Chemistry 235.235 (1960):1488.
6. Holley, R. W., Everett, G. A., Madison, J. T., & Zamir, A*. "NUCLEOTIDE SEQUENCES IN THE YEAST ALANINE TRANSFER RIBONUCLEIC ACID." Journal of Biological Chemistry 240 (1965):2122.
7. Alarcón, C. R., et al. "HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events. " Cell 162.6 (2015):1299-1308.
8. Alarcón, C. R., et al. "N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing." Nature 519.7544(2015):482.