编译：微科盟艾奥里亚，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
阿莫西林-克拉维酸(Amoxicillin-clavulanic acid，AMC)是西方世界最常用的抗生素制剂之一。广泛口服这种抗菌药物复合制剂会对肠道微生物菌群造成影响。双歧杆菌属(Bifidobacterium)是定植在人类肠道微生物菌群中最丰富的微生物之一，它由许多对宿主有益的不同的分类群组成。本研究中，我们通过对23名接受AMC治疗的儿童和19名在先前6个月内没有接受AMC治疗的儿童的肠道菌群进行比较，探究了AMC给药对肠道菌群组成的影响。此外，我们还对261株双歧杆菌进行了最低抑菌浓度(MIC)试验，这其中包括目前公认的64种双歧杆菌(subsp.)的参考菌株，以及197株人类来源的双歧杆菌分离株。通过这些评估，我们鉴定出四种对AMC高度不敏感的双歧杆菌菌株，基于对这些菌株进行的基因组和转录分析，我们确定了导致这种AMC不敏感的假定遗传决定因素。此外，通过体外分批培养我们还探究了耐AMC双歧杆菌菌株的生态学作用。双歧杆菌是一种常见于婴儿肠道的细菌属，根据本研究结果，我们观察到接受抗生素治疗的儿童的肠道微生物菌群多样性急剧减少，这也影响了双歧杆菌的丰度。MIC实验表明，98%以上的双歧杆菌菌株能够被AMC抗生素抑制。对四株不敏感菌株的分离和基因组测序揭示了参与AMC抗性机制的可能基因的同一性。此外，体外肠道模拟实验表明，Bifidobacterium breve PRL2020，能够在微生物群与AMC抗生素共存的条件下长期存在。
原名：Amoxicillin-Clavulanic Acid Resistance in the Genus Bifidobacterium
译名：双歧杆菌属的阿莫西林-克拉维酸耐药性
期刊：Applied and Environmental Microbiology
IF：4.016
发表时间：2021.1.22
通讯作者：Francesca Turron
通讯作者单位：帕尔玛大学（University of Parma）
本研究共收集42份人类粪便样本，分为两组：第一组为23名因呼吸道感染而接受AMC(阿莫西林：克拉维酸比例为7：1)治疗的儿童的粪便样本；第二组为19名健康儿童的粪便样本。采集的样本由大约10克新鲜粪便材料组成，保存在冰块上，在零下条件下运往实验室，并在-80°C下储存，并用于后续分析。基于16S rRNA测序，我们比较了不同组别儿童肠道微生物组成上的差异；基于流式细胞测定，我们定量分析了粪便样本中的微生物绝对细胞计数；基于菌株的分离以及最低抑制浓度测定，我们探究了所有菌株的抗生素抗性；基于比较基因组学，我们探究了所分离的高抗生素抗性菌株的蛋白质编码家族。
为了评估23名接受AMC治疗的呼吸道感染儿童(AMC组)与19名在过去6个月内未服用任何抗生素的健康、年龄匹配的儿童(对照组，CTRL组)肠道微生物菌群组成的差异，我们对两组儿童的粪便样本进行了16S rRNA基因测序。我们共得到了2,274,698个reads，平均每个样本有54,159 ±11,080个reads。箱线图分析显示，两组之间具有显著差异(图1)。具体而言，基于16S rRNA基因的分析显示，与AMC组相比，CTRL组的微生物菌群的多样性更高(P=0.03)，这表明微生物菌群的组成受到抗生素治疗的显著影响（图1a）。为了探究粪便样本中细菌的绝对丰度，基于流式细胞仪，我们对所分析粪便样本中存在的微生物细胞进行了计数。通过分析发现，AMC样本的微生物丰度显著低于CTRL组（AMC和CTRL组的平均绝对细菌丰度分别为2,448,888 ± 2,875,900和5,438,290 ± 3,345,390；P=0.001，图1b）。由于AMC组儿童受到的抗生素治疗所施加的强烈选择压力，我们的分析揭示了AMC组与CTRL组微生物群在属水平上的组成差异。基于线性判别分析效应大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）统计分析比较发现，CTRL组中有25个属的绝对丰度显著升高，如Dialister（P=0.0001）、Roseburia（P=0.001）、Ruminococcus（P=0.013）、Agathobacter（P=0.008）和Odoribacter（P=0.009）（图1b）。这一发现与先前评估接受抗生素治疗的个体的微生物群的其他研究一致。在本研究中同样发现，CTRL组中Bifidobacterium的绝对丰度减少了1.8倍，揭示了抗生素的使用和这种细菌属的减少之间可能存在相关性。Bifidobacterium被广泛认为是健康肠道状态的阳性生物标志物，是婴儿微生物菌群的特征。虽然没有观察到统计上的显著差异，但该属成员的减少与先前的数据一致。基于加权的UniFrac距离度量对β多样性进行分析，以评估AMC和CTRL样本之间的个体差异(图1c)。通过主成分分析（PCoA分析）我们可以发现，AMC和CTRL组样本明显分离，形成两个不同的簇(P=0.001，图1c)。此外，基于对宿主年龄进行PCoA分析发现，宿主年龄与肠道菌群分布无相关性(PERMANOVA P=0.541，adonis P=0.0 6，R2=0.04)。综上，不同样本之间的微生物菌群显著不同，与对照组儿童相比，接受抗生素治疗的儿童的肠道细菌通常都表现的很枯竭，这突显了AMC对微生物菌群组成的有害影响。
图1 AMC组和CTRL组样本微生物组成比较。(a)以箱线图的形式绘制了从AMC和CTRL样品中鉴定到的OTUs情况；(b)在通过流式细胞分析对每个样本中的微生物细胞数定量归一化后，根据16S rRNA结果统计的AMC和CTRL样品的微生物菌群组成；(c)代表AMC和CTRL样品中的Beta多样性。双歧杆菌普遍存在于婴儿的肠道微生物菌群中，且被视为是肠道健康的微生物生物标志物。抗生素的使用与双歧杆菌属丰度下降之间的可能关联促使我们探究该属的物种对AMC的敏感性。为了评估双歧杆菌属不同菌株的AMC敏感性，我们对237个不同的菌株进行了最低抑菌浓度(MIC)测定，这其中包括目前公认的63个双歧杆菌( subsp. )的模式菌株和属于四个双歧杆菌种的174个不同的菌株，即Bifidobacterium adolescentis，Bifidobacterium bifidum，Bifidobacterium breve，以及Bifidobacterium longum。此外，为了分离得到对AMC不敏感的双歧杆菌菌株，我们在接受AMC治疗的个体的粪便样本中分离出24个双歧杆菌新菌株，其中18个属于B. longum种，3个属于B. breve种，3个属于B. pseudocatenulatum种。所有受试菌株的AMC MIC(MICAMC)断点均呈单峰分布，范围为0.125~32 mg/mL。其中96.5%的菌株MIC ≤ 1 mg/mL，5株双歧杆菌的MIC为2 mg/mL，4株双歧杆菌的MIC大于或等于4 mg/mL。有趣的是，新分离的B. breve PRL2020菌株显示出最高的MICAMC值，为32 mg/mL(表1)，比双歧杆菌的平均MICAMC高11倍。此外，B. breve菌株M1D的MIC值为16 mg/mL，是双歧杆菌MICAMC平均值的5倍(表1)。此外，两个B. longum种的分离株（B. longum subsp. longum 1898B和B. longum subsp. longum 39B）的MIC值分别为8 mg/ml和4 mg/mL(表1)，分别是其他B. longum菌株平均MIC值的8倍和4倍。这些发现表明，对AMC的不同抗性/不敏感程度反映了菌株特有的特征，而不是物种特有的特征。值得注意的是，98.5%的被测试双歧杆菌菌株的MICAMC值都低于人类肠道微生物菌群的其他物种(如Escherichia coli，Citrobacter spp.，Bacteroides spp.和Parabacteroides spp.)。有趣的是，这些数据表明双歧杆菌的AMC耐药/不敏感性似乎不遵循垂直进化途径，而可能是以一种与其他肠道共生微生物相似的通过水平基因转移(HGT)所获得。最后，我们评估了对AMC不敏感的四株双歧杆菌对阿莫西林的敏感性。通过研究我们发现，各菌株均表现出较高的MIC值，其中B. breve PRL2020的MIC值为64 mg/mL，B. breve菌株M1D的MIC为32 mg/mL，B. longum subsp. longum 1898B和B. longum subsp. longum 39B的MIC值为8 mg/mL，这些数据进一步证实了这些菌株对阿莫西林的耐药性，综上，无论是作为单一抗生素使用还是与克拉维酸联合使用，这些菌株都表现出较高的耐药性。表1 AMC标本中分离的双歧杆菌菌株及其MICAMC值
3 AMC敏感双歧杆菌比较基因组学及可能耐药基因的鉴定为了确定与AMC不敏感有关的4个双歧杆菌菌株的遗传特征，我们对B. breve PRL2020、B. breve M1D、B. longum subsp. longum 39B以及B. longum subsp. longum 1898B的基因组进行了测序、注释和生物信息学分析，这些菌株都表现出较高的MICAMC(表1)。这四个新分离的双歧杆菌染色体的覆盖深度及组装后产生重叠群信息如表2所示。预测的开放阅读框数(ORF)在1,842到2,102之间(表2)。基于目前已有的染色体序列，我们对B. breve PRL2020、B. breve M1D、B.longum subsp. longum 39B以及B. longum subsp. longum 1898B的染色体与目前已获得的B. breve和B. longum subsp. longum的染色体进行了比较。生物信息学分析显示，所分析的B. breve菌株之间共享了1,272个基因，代表该分类群的核心基因组(图2a)，而B. longum subsp. longum的核心基因组由1106个基因组成。此外，在这两个被调查的物种中，每个物种都有数量不等的真正独特的基因(TUG)，其范围从B. breve UCC2003的175个到B. breve 7E的41个，从B. longum subsp. longum 1897B的585个到B. longum subsp. longum 39B的113个（图2b）。有趣的是，这一分析揭示了B. breve AMC不敏感菌株（B. breve PRL2020和B. breve M1D）之间共存的323个共有的辅助基因，而这些基因在AMC敏感B. breve菌株中则不存在(图2a)。此外，AMC抗性菌株B. longum subsp. longum 39B and B. longum subsp. longum 1898B之间包含25个共享基因，但这些基因在其他分析的B. longum菌株中是缺失的(图2a)。此外，基于MEGARES数据库我们对4株已鉴定的AMC不敏感双歧杆菌的基因组进行筛选，以确定可能的抗生素耐药(AR)基因。生物信息学分析表明，我们在B. breve PRL2020、B. breve M1D、B. longum subsp. Longum 39B以及B. longum subsp. longum 1898B中预测的抗性组从B. breve M1D的167个基因到B. longum subsp. longum 1898B的175个基因(图2b)。在目前的分析中，我们包括了编码抗生素清除转运蛋白的序列以及指定抗生素失活酶的序列。这其中，我们预测抗生素清除转运子数量范围在109到127之间(图2b)。此外，对生物信息学的耐药组数据的进一步分析以及在不敏感株中发现的但在敏感株中缺失的基因之间的比较，我们识别出11个预测的AR基因，这些基因只存在于B.breve AMC抗性菌株中。这其中有8个预测编码转运蛋白，而两个基因编码能够抵抗糖肽抗生素的酶。另一个编码参与脂多糖修饰的糖基水解酶的基因。此外，对B. longum subsp. longum的成员也进行了同样的分析。在该分类群中，我们只鉴定了一个共享于B. longum subsp. longum的基因，该基因被预测为编码AR的转运蛋白基因。上述这些已鉴定的基因被证明是在B. breve PRL2020、B. breve M1D、B.longum subsp. longum 39B和B. longum subsp. longum 1898B中鉴定的高MICAMC断点值的可靠候选基因。
图2 抗AMC双歧杆菌株的基因组和抗性分析。a代表了不同菌种下菌株之间共享和差异的核心基因组数量的Veen图；b代表预测抗AMC双歧杆菌菌株的抗性。
4 Bifidobacteriumbreve PRL2020的转录组分析为了研究生长培养基中AMC的存在是否调控以及如何调控与上述AR有关的基因的转录，我们研究了B. breve PRL2020在AMC存在与否的条件下在De Man、Rogosa和Sharpe(MRS)培养基中培养时的转录组。结果表明，163个基因发生显著变化，其中109个基因在MRSAMC培养基中表达上调，52个基因表达下调(图3)。根据eggNOG数据库对上调和下调的转录基因进行功能鉴定可以发现，高表达的转录本与防御机制和无机离子代谢和运输相关的基因相对应(分别为20.2%和9.2%)(图3)。相反，下调的转录本对应于参与碳水化合物和核苷酸运输和新陈代谢的基因(分别为13.7%和25.5%)。有趣的是，在上调的基因中，与位点标签PRL2020_1181相关且编码ABC转运蛋白的一个特定的ORF，其转录增加了3.6倍(P=0.0001)(图3)。该基因存在于B. breve PRL2020菌株中，且与其他B. breve AMC耐药株共享，但不存在于B. breve AMC敏感株中。这些发现表明这个ABC转运蛋白编码基因与B. breve PRL2020对AMC的表观不敏感性有关。此外，在B. breve PRL2020株基因组中观察到的两个TUG，即ORF PRL2020_1167和PRL2020_1282，在AMC的存在下被诱导转录，分别上调3.4倍(P=0.039)和2.7倍(P=0.049)(图3)，并且这两种情况下都编码我们假设蛋白。这些数据表明，这些独特的基因与B.breve PRL2020对AMC抗生素的高耐药性有关。
图3 在AMC存在下B. breve PRL2020基因的转录调控。5 AMC存在下耐药双歧杆菌菌株对人体肠道微生物菌群的影响
肠道微生物菌群的组成受抗生素化合物的影响，这种影响在婴儿肠道内尤为明显。为了探究在AMC不敏感双歧杆菌菌株的存在下，AMC对人体肠道微生物菌群的影响，我们采集了三种不同的新鲜婴儿粪便样品并进行了四种不同条件下的共培养实验：(i)单独粪便样本培养体系；(ii)粪便样本与AMC不敏感菌株共培养体系；(iii)粪便样本与AMC共培养体系以及(iv)粪便样本与AMC和AMC不敏感菌株共培养体系。各培养体系分别在12h、18h、24h和36h四个不同的时间点急性取样监测。基于不同时间点宏基因组学分析，我们共获得4,659,664个reads，平均每个样本存在38,831 ±21,806个reads。进一步采用流式细胞分析技术以对微生物细胞进行计数，我们发现，每个共培养实验与其自身对照的比较显示，在加入AMC的培养体系中，95%的样本中的微生物细胞数量有所减少(图4a)。统计分析显示，与对照组(平均1.33*108 ± 8.21*107)相比，用药组细胞数(平均6.85*107 ± 4.32*107)减少了1.94倍(P=0.0001)。
但我们聚焦于与已鉴定的AMC抗性双歧杆菌相对应的物种的绝对丰度时，我们发现，经AMC处理后B. breve PRL2020和B. breve M1D的丰度似乎有所增加(图4b)。事实上，但用AMC处理粪便样品，且与PRL2020或M1D共培养时，与未处理的粪便样本相比，B. breve的丰度有所增加(图4b)。此外，B. breve PRL2020菌株对AMC的抗性最强，但只有33%的样品的AMC丰度下降了50%，而B. breve M1D菌株的丰度在50%的样本中下降了50%(图4b)。与之相反的是，B. longum subsp. longum 39B和B. longum subsp. longum 1898B的绝对丰度的降幅总是大于50%(图4B)。综上，这些结果可能支持了B. breve PRL2020在AMC抗生素存在下生长能力的明显提高，使该菌株成为开发含双歧杆菌益生菌产品的有趣候选菌株。当然，进一步的体外实验旨在评估该菌株在胃肠道中存活的能力，并在工业化生产和储存过程中获得高水平的生存能力，可能会促进B. breve PRL 2020菌株成为一种可能的新型健康促进细菌。
图4 在培养基中细菌的生长实验。a代表共培养实验中，MRSAMC以及其对应条件下细菌绝对丰度比较；b代表所分析菌株对应的细菌种类的绝对丰度，AMC处理的样品和未处理的样品之间的相对百分比差异。
许多药物都会人体肠道微生物菌群造成影响。阿莫西林和克拉维酸的组合是西方世界最常用的抗生素之一（特别是在婴幼儿和青春期），因此，我们探究这这种抗生素主配方式对23名儿童肠道微生物菌群的影响，并将其与没有接受AMC治疗的对照组进行比较。结果表明，与CTRL组相比，接受AMC治疗的儿童细菌数量急剧减少，包括双歧杆菌属的绝对丰度降低。进一步通过最低抑制试验我们可以发现，98.5%的菌株对该抗生素敏感。但我们分离到4株具有较高抗性的分离株，这其中B. breve strain PRL2020的MICAMC值最高。在分子信息学研究中，我们识别出几种对AMC具有较高抗性的候选基因。在后续研究中，我们将通过应用基因失活方案以及预测的AMC耐药基因在敏感双歧杆菌中的异源表达，进一步研究观察到的AMC耐药的遗传决定因素和分子机制。最后，通过模拟肠道微生物菌群实验发现，PRL2020菌株能够在复杂的微生物菌群与AMC抗生素结合的情况下存活。本研究的发现为开展AMC疗法时将PRL2020菌株用于益生菌产品提供了可能性。
