科研 | Science：肠道共生微生物群影响转移性黑色素瘤的抗PD-1治疗效果！
导读
近年来，免疫治疗对肿瘤的治疗产生了重大影响，PD-1抗体更是为很多患者带来了生存的希望，但仍只有一小部分患者受益。有研究表示人体的微生物组作为人类的第二基因组，可能是导致个体差异的原因之一。临床前小鼠模型的研究结果显示共生微生物对肿瘤的免疫治疗效果有一定的影响，有“良好微生物”组成的小鼠对抗PD-L1的治疗活性远高于拥有“不利微生物”的小鼠，且这种有益菌可以通过同笼饲养或粪便移植的方式发生转移。
相关的小鼠研究表明，某些共生的肠道菌群具有免疫抑制的潜力，例如通过诱导Foxp3调节的T细胞；据报道，其他细菌相比，Collinsella aerofaciens和Bifidobacterium adolescentis等菌属可导致外周来源的结肠调节性T细胞频率降低；这些结果提示我们，共生微生物群可能对癌症患者的抗肿瘤免疫反应存在某种调节机制。
肠道微生物组是否会影响转移性黑色素瘤的抗PD-1治疗效果？本研究通过方法是16S核糖体RNA基因测序、微生物鸟枪法测序和特定菌属的定量聚合酶链反应(PCR)等方法，采集转移性黑色素瘤患者治疗前的基础粪便样本，与治疗效果进行了分析，以期发现可预测患者疗效的标志菌属，进一步在小鼠上设计实验进行验证并检测部分相关免疫指标以期发现潜在机制。
原名：The commensal microbiome is associated with anti–PD-1efficacy in metastatic melanoma patients
译名：肠道共生微生物群影响转移性黑色素瘤的抗PD-1治疗效果！
期刊：Science
IF：37.205
发表时间：2018年
通信作者：Thomas F. Gajewski
通信作者单位：University of Chicago
1、16S rRNA测序发现63个可区分患者疗效的OTUs
本研究采用实体肿瘤疗效评价标准1.1版（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors (RECIST) version1.1）评价患者抗PD-1治疗的疗效，应答者（Resopnder，R）为16人，非应答者（Nonresponders，NR）为26人，对这些患者治疗前的粪便进行16S核糖体RNA基因测序分析，结果共发现62个显著性差异的OTUs，其中39个在R组中含量更丰富,而其他23个在NR组中含量更丰富（Fig1A）；其中，一种Bifidobacteriaceae的OTU在R组中含量显著高于NR组，且另一种Bifidobacteriaceae OTU（559527）在R组和NR组之间存在边界显著性（P=0.058），该OUT也被纳入到分析中（总OTUs=63）。对这63个OTUs进行主成分分析发现，NR组与R组分区明显（图1B）。鸟枪法测序进一步分析发现，有43个潜在的物种与16SrRNA测序的OTUs相匹配。
图1 16S rRNA基因扩增序列分析结果.(A): R组与NR组菌群的相对丰度差异，63个OTUs具有统计学差异（P<0.05，置换检验）；（B）图A中OTUs的PCA分析。
2、qPCR验证并整合上述测序结果，发现10种具有显著性差异的物种
结合3种方法，最终发现8种菌种在R组中富集：Enterococcus faecium、Collinsella aerofaciens、Bifidobacterium adolescentis、Klebsiella pneumoniae、Veillonellaparvula、Parabacteroides merdae、Lactobacillus sp.和Bifidobacterium longum；以及2种在NR中含量更丰富的菌种：Ruminococcusobeum和Roseburia intestinalis。
3种方法的结果见图2A-C（以B. longum为例）。此外，本研究将这10个菌种的qPCR总评分与患者的疗效进行分析，发现R组的分值显著高于NR组（图2D）
图2 相关物种的qPCR鉴定及结果。仅43个经鸟枪法确证过的OTUs纳入到qPCR的试验中。Wilcoxon-Mann-Whitney检验(非参数)比较R组和NR组的定量PCR评分；P<0.05被认为具有统计学意义; *P < 0.05, **P < 0.01,***P< 0.001, ****P < 0.0001。
3、 “有益” 和“非益” OTUs总数的比值可预测患者疗效
汇总数据作为候选的生物标志物是近年来研究的发展热点，学者们认为众多生物标志物的整和能更好的预测患者响应。本研究统计了每个患者“有益OTUs总数”/“非益OTUs总数”的比值，发现该比值大于1.5时，所有患者均表现出临床响应，表明微生物组成可以作为预测患者疗效的生物指标（图2E）。
图2 各患者OTUs总数比值与疗效的关系。虚线RECIST=-30%、ratio=1.5可显著区分患者疗效；RECIST用于评估患者肿瘤大小的绝对变化。
质控得到的15名患者（5R，10NR）的预处理肿瘤标本中，R组与NR组之间的微生物组成仍存在显着差异（P <0.01）（图S6A和B），表现为qPCR评分和“有益OTUs总数”/“非益OTUs总数”的比值具有显著性差异。外显子组测序发现，非同义体细胞突变、PD-L1和PD-1 mRNA水平（图S6C至E）和CD8 + T细胞（图S6F）在R组中呈现增高趋势。
图 S6 qPCR评分和有益/非益OTUs比作为PD-1抗体临床疗效的预测指标（Student’s t-test）
4、人体的共生肠道菌群对小鼠（黑色素瘤模型）抗肿瘤免疫的调节作用
该研究从R组和NR组各选取3名患者（R:P28, P34, P09；NR：P06, P21, P11），将这6位患者的粪便分别灌胃移植到6组无菌的B16.SIY黑色素瘤小鼠体内（具体分组见实验设计，每组7-11只小鼠）。观察小鼠体内肿瘤的生长情况；采集小鼠粪便并进行16S rRNA测序并与人体肠道菌群结构及组成进行比较。
结果显示移植了R组粪便的小鼠中有2组生长较慢,而移植NR组粪便的小鼠有2组生长较快，具有统计学差异（图3A），重复实验中的小鼠肿瘤生长率和微生物组成高度一致（图3B；A1与A2对比，B1和B2对比）；进一步针对A、B组小鼠用酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT)对脾细胞进行体外刺激，结果表明，接种B16.SIY的黑色素瘤细胞3周后，移植R组粪便的重组小鼠（A组）体内T细胞活化的频率增加（图3C）；并且A组小鼠的特异性SIY CD8+ T细胞而不是Foxp3 CD4+ T细胞的数量显著增加（图3D＆E），这与肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞的启动增强相一致；此外，A组小鼠的抗PD-L1效果显著，而B组（移植NR组患者粪便）则几乎无效（图3F）。最后，该研究对上述人体内发现的10个差异菌属移植给小鼠上，发现其中6种菌属的富集形式与患者供体的相似(图3G)。
图3. 人类肠道菌群对小鼠黑色素瘤模型抗肿瘤免疫的调节作用。肿瘤生长曲线采用TUKEY多重比较后检验的双向方差分析；流式细胞术和定量PCR数据采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验(非参数)；P<0.05被认为具有统计学意义; *P < 0.05, **P< 0.01,***P < 0.001, ****P <0.0001.。
综上，该研究的数据显示，黑色素瘤患者共生肠道菌群的组成与抗PD-1单克隆抗体的疗效有关，且 “有益”与“非益”OTUs的比例以及多个菌属的qPCR总分是临床疗效有力的预测指标；此外，该研究展开了小鼠动物实验，将人类粪便移植到无菌小鼠体内，基本重现了人类肠道微生物的组成及表型，移植了R组粪便的小鼠其抗PD-L1的疗效更好，进一步的流式细胞实验提示我们共生微生物群影响肿瘤患者的治疗效果可能存在某种免疫机制。
该研究为微生物组学、肿瘤基因组学和种系遗传学的整合研究开辟了一条新道路，且该研究结果发现的“有益”与“非益”OTUs的比例、qPCR总分能较好的预测患者对抗PD-1免疫治疗的疗效，具有一定的临床转化意义；不仅如此，该研究在小鼠身上进行了一系列验证并发现了某种潜在机制，为后续的机制研究奠定了基础。但该研究的样本量仍较小，且免疫相关实验未能在人体内进行检测，后续仍需进一步扩大样本量验证并深入探索机制。
本文由周皓编译，莫秋芬、江舜尧编辑。