科研 | 浙江大学Environmental Pollution：农用杀菌剂增加了温室土壤抗生素抗性基因的丰度
编译：红皇后，编辑：小菌菌、江舜尧。
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温室作物种植中长期使用杀菌剂导致其在土壤中的残留污染问题，同时会改变土壤微生物群落结构组成，然而，目前还不清楚这些残留的杀菌剂是否会影响温室土壤中抗生素抗性基因 (Antibiotic resistance genes, ARGs) 的多样性和丰度。本研究在实验室条件下，分析了温室和山地土壤中杀菌剂的残留动态并利用宏基因组测序研究了其对ARGs的影响。
研究发现，温室土壤相比于山地土壤具有更高的ARGs多样性和丰度；多菌灵、嘧菌酯和百菌清的使用可能会导致温室土壤中ARGs总丰度的增加，并且对sul2、sul1、aadA、tetL、tetG和tetX2的影响最为明显；温室土壤中ARGs的丰度与可移动遗传元件(Mobile genetic elements,MGEs) 的丰度具有显著相关性，但是这种相关性在山地土壤中并不存在；ARGs和MGEs的共检出网络发现了部分ARGs与MEGs可能位于同一基因单元中，并通过宏基因组组装得到的contigs得到了验证；温室土壤中的ARGs的主要宿主是肠杆菌，而山地土壤中ARGs的主要宿主是放线菌。本研究结果表明一些杀菌剂是温室土壤中ARGs的一种选择性压力，会导致ARGs通过MEGs介导的水平基因转移(Horizontal gene transfer,HGT) 进行传播。
论文ID
原名：Fungicides enhanced the abundance of antibiotic resistance genes in greenhouse soil
译名：农用杀菌剂增加了温室土壤抗生素抗性基因的丰度
期刊：Environmental Pollution
IF：5.714
发表时间：2020
第一作者：张厚朴
通讯作者：方华
通讯作者单位：浙江大学农业与生物技术学院
实验设计
本研究在室内构建了温室土壤和山地土壤的微宇宙系统，分别向土壤中添加4种杀菌剂 (嘧菌酯、多菌灵、三唑酮和百菌清)和一种抗生素 (金霉素)，添加量均为10 mg/kg，并使用未添加任何化合物的土壤作为对照，每个微宇宙含有1kg的土壤，每个处理三个重复，分别在0、1、3、7、15、30和60天采集土壤样本。
图0 Graphic Abtract
分别使用特定的萃取方法从土壤样本中提取杀菌剂和抗生素，随后使用HPLC和GC对其浓度进行测定。使用FastDNA SPIN Kit for Soil提取土壤样本的DNA，应用Illumina HiSeq 2500平台采用PE150bp策略进行宏基因组测序。
使用NGS-QC Toolkit对宏基因组数据进行质量控制，之后将Clean reads按照PE信息拼接为itags，应用BLAST将这些itags分别与ARDB、INTEGRALL和NCBI RefSeq质粒数据库进行比对，注释其中的ARGs和MGEs，同时将itags与Greengene数据库比对注释细菌16S rRNA基因，最后根据注释的结果计算ARGs和MGEs的丰度，单位为“copyof ARGs per copy of 16SrRNA gene”。
使用IDBA算法将宏基因组数据拼接为contigs，应用Prodigal进行开放阅读框识别，将开放阅读框的蛋白质序列利用BLAST与ARDB进行比对注释可能的ARGs，将含有ARGs的contigs中的其它开放阅读框与NCBI NR数据库比对，筛选其中包含的MGEs。将ARGs的比对结果输入MEGAN6鉴定其宿主种类。
结果
1 杀菌剂和抗生素的消解动力学
所有样本中杀菌剂和抗生素的消解均符合一级动力学模型，在温室土壤中，嘧菌酯、多菌灵、三唑酮、百菌清和金霉素的半衰期分别为64.36、37.34、12.74、10.27和16.23天，而在山地土壤中，这些化合物的半衰期分别为100.75、37.07、32.42、15.32和36.52天，整体来说温室土壤中杀菌剂和抗生素的消解速率要明显高于山地土壤，这可能是由于两种土壤不同的理化特性和微生物群落导致的。温室土壤中较高的pH和较低的有机质含量可能是导致百菌清消解速率较快的原因，同时之前杀菌剂等化合物的暴露可能会导致温室土壤中杀菌剂降解微生物的驯化富集，这也是温室土壤杀菌剂消解速率较快的可能原因之一。本研究中所使用的温室土壤均来自于一个蔬菜种植大棚，并且有两年的百菌清使用历史，虽然在建立微宇宙之前并未检测到明显的杀菌剂残留，之前杀菌剂的使用同样有可能增加了土壤中杀菌剂降解微生物的丰度。
图1 温室和山地土壤中杀菌剂和金霉素的消解动力学
2 温室与山地土壤ARGs图谱的比较
本研究中共检出了18类ARGs，其中温室土壤检出17类，山地土壤检出13类，温室土壤中ARGs的总丰度为0.27，显著高于山地土壤，本研究检出的ARGs丰度与前人在农田土壤中检测到的结果类似，这可能与温室土壤中长期使用有机肥有关。温室土壤中的ARGs主要是磺胺类抗性基因、多抗基因、四环素类抗性基因和氨基糖苷类抗性基因，这与前人对其它温室土壤的研究结果一致。山地土壤中丰度最高的ARGs是多抗基因，占总ARGs的54.81%，由于ARGs早于人类活动就已存在，因此在山地土壤中检出ARGs是很正常的。
图2 温室和山地土壤中ARGs的相对丰度
本研究中，温室土壤检出ARGs 35-53种，山地土壤则为10-21种，温室土壤中ARGs的多样性显著高于山地土壤。同时，ANOSIM和NMDS分析表明，温室土壤和山地土壤ARGs图谱具有显著的差异。在温室土壤中，丰度最高的10种ARGs为sul2、sul1、aadA、mexB、acrB、mexF、tetL、bacA、tetA和tetX2，占总ARGs的69.10%，而山地土壤中，优势的ARGs为acrB、mexF、macB、bpeF、bacA、rosA、blaGIM-1、sul1和cmlA，占总ARGs的54.98%。山地土壤中优势ARGs的作用机制是外排泵，这与受到人类影响较小的南极土壤中优势ARGs类型一致。
在温室和山地土壤中，共检出38种ARGs，分别属于9个不同的类别，其中最优势的是多抗基因，并且几乎全部编码RND外排泵。研究报道森林土壤中含有多种土著微生物产生的抗生素和其它化合物，这驱动了森林土壤微生物组中ARGs的进化，mexF多抗基因在超过4000km范围内的森林土壤中广泛分布。此外，编码多药物外排泵的ARGs同样也广泛存在于南极土壤中。。本研究发现的其它共有ARGs主要为四环素类抗性基因，其中大部分均编码MFS外排泵，其为细菌中一种十分重要的多药物抗性机制。与RND外排泵类似，MFS外排泵同样具有一个十分广泛的底物范围，能够排出细菌内的多种物质。
图3 温室和山地土壤中共有和特有ARGs分析
3 杀菌剂增加土壤中ARGs的丰度
经过60天的实验室模拟，无论是在温室还是山地土壤中，三唑酮的添加没有促使ARGs的丰度发生明显变化，但是多菌灵、嘧菌酯和百菌清的使用显著提高了土壤中ARGs的丰度。近期有研究发现ARGs在多环芳烃污染的土壤中显著富集，三氯生也被发现能够显著富集土壤中的ARGs，此外，已有研究表明杀菌剂能够增强土壤微生物群落对抗生素的抗性。在杀菌剂诱导ARGs富集的过程中，杀菌剂的结构发挥了重要的作用，类似的结果同样在离子液体的研究中被发现，因此杀菌剂可以作为一种选择性压力导致土壤微生物群落中ARGs的富集。
4 ARGs与MGEs的相关性
由整合子和质粒等MGEs介导的HGT是环境中ARGs传播的主要机制，本研究中温室土壤中质粒和整合子的多样性及丰度均明显高于山地土壤，其中intI1在温室土壤中丰度很高，而在山地土壤中却很少检出，这与intI1可以作为人类活动的指示基因相一致。此外，在温室土壤中，MGEs与多种优势的ARGs存在显著的正相关，而在山地土壤中，与MGEs相关的ARGs数目非常少。
图4 ARGs与MGEs的相关性热图，上半部分为温室土壤，下半部分为山地土壤
但是相关性分析不足以直接证明MGEs参与了ARGs的传播，本研究进一步通过宏基因组组装查找ARGs与MGEs的共存依据，在温室土壤中，共发现了25对ARG与MGE位于同一个contigs中的现象，例如sul1与转座酶、sul2与tnpA，这证明温室土壤中杀菌剂残留所带来的选择性压力可能会导致ARGs通过MGEs介导的HGT进行传播和增殖。
图5 ARG与MGE在同一条contigs上共存排列
5 温室和山地土壤中ARGs的宿主
在温室土壤中，共鉴定到26个潜在的ARGs宿主细菌属，其中Acinetobacter是检出频率最高的，其可能是sul1、aadA2和cml5的宿主，而Salmonella可能是sul2和tetG的宿主。网络分析表明，在温室土壤中，万古霉素抗性基因vanR具有最广泛的宿主范围，其次为sul1和sul2。在山地土壤中，共鉴定到21个ARGs的潜在宿主，其中最主要的宿主是Nocardia和Streptomyces，与温室土壤一样，vanR基因同样是山地土壤中宿主范围最广的ARG。
图6 温室和山地土壤中ARGs宿主微生物的识别。a 温室土壤中携带ARG的contigs的分类学结果，b 山地土壤中携带ARG的contigs的分类学结果，c-d温室和山地土壤中ARG预测宿主的关联网络。
评论
ARGs作为一种新兴的环境污染物质，近些年来的研究十分火热，随着宏基因组测序成本的下降，越来越多的研究人员开始使用宏基因组分析环境中ARGs的传播。在通常人们的印象中，抗生素是ARGs富集和传播的主要因素，但越来越多的研究发现，多种非抗生素类物质同样会导致ARGs的富集，包括重金属、离子液体、消毒剂、多环芳烃等等。本研究分析了杀菌剂在温室土壤中对于ARGs的富集作用，并进一步通过与MGEs的关联，证明了杀菌剂会促进MGEs的水平基因转移从而实现ARGs的增殖和传播。
由于ARG的特殊性质，大多数ARGs可能在微生物中并不发挥抗生素抗性功能，而是微生物自身生理功能的必要组成部分。目前发现的环境中ARGs传播的机制基本上是水平基因转移和依赖细菌群落变化两种，那么不难想象，能够影响水平基因转移或者改变微生物群落结构的其它污染物，必然也会影响ARGs的组成结构，因而，非抗生素类物质对ARGs的影响其实还有很多研究可做。
本研究的另一个亮点是通过对宏基因组组装contigs的分类学注释，一方面鉴定了ARG的宿主，另一方面也直接证明了ARG和MGE存在于同一段基因单元上，为MGE介导ARG的传播提供了有力的证据，而大部分类似的研究还只是停留在相关性分析结果。
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