综述 | Nutrition Reviews：人类母乳微生物组组成
编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。
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母乳（HM）包含各种微生物。这些微生物可能有助于婴儿胃肠道微生物的生长，影响婴儿的免疫和代谢发育及后期健康。鉴于HM微生物群的重要性，越来越多的研究集中于不同人群和不同母婴的菌群特征。但是，尽管进行十年的深入研究，该领域仍然存在一些未解决的问题。
在这篇综述中，应用“5 W+H”方法（who, what, when, where, why, how）全面描述HM微生物组的组成、功能和起源。本文收集现有的证据，并进行批判性的评估，强调进一步研究的途径，包括基础研究和应用研究。其中最有趣的是利用益生菌或饮食干预调节HM微生物组的潜力。另一种潜在的应用是为母乳不足的婴儿提供合理的捐赠母乳，通过对HM微生物组更深入了解，可以找到合适的干预方法，保障婴儿终身健康。
论文ID
原名：The human milk microbiome: who, what, when, where, why, and how?
译名：人类母乳微生物组组成、功能、何时产生、从哪里来以及其研究意义及方法
期刊： Nutrition Reviews
IF：5.779
时间：2020.5
通讯作者：Lisa F. Stinson
通讯作者单位：西澳大利亚大学
内容大纲
人体微生物群是宿主生理学的重要合作者。多样性的群落对于免疫和消化系统的正常运转非常重要。越来越多的证据表明，破坏细菌群落，特别是在生命早期，会导致非传染性疾病的发展。虽然最初认为母乳是无菌的，但现在认为其是有益微生物的主要来源，是婴儿胃肠道微生物组的主要驱动力。近年来，人们对HM微生物的研究兴趣不断增加，在这个领域有许多令人兴奋的研究方法，可以帮助改善产妇、婴儿和终身健康。本文中将使用5 W + H方法深入讨论HM微生物组。更具体地说，该综述将回答以下问题：
1.谁构成了母乳中的微生物群?
1.1 细菌
1.2 病毒
1.3 真菌
1.4 古菌
2.母乳微生物群的功能是什么？
3.母乳微生物群何时形成?
4.母乳中的微生物群来自哪里?
4.1 孕产妇皮肤
4.2 婴儿口腔
4.3 产妇胃肠道
4.4 持续的流入还是停留的微生物群
5.为什么要研究母乳中的微生物群?
5.1 HM菌群的调节
5.2 捐赠母乳的个性化
5.3 婴幼儿配方奶粉优化
6.如何研究母乳中的微生物群?
主要内容
1.谁构成了母乳微生物群？
对HM微生物组的研究，主要集中于细菌。但是，HM含有多种微生物，涵盖了生命的每个领域（图1）。以下描述HM中存在的主要分类群，重点是跨种群的HM样本似乎共有的分类群。
图1.在母乳中发现的最丰富和最普遍的微生物。古菌对人乳菌群的贡献目前还不清楚。
1.1细菌
已经证实HM中存在活菌。在HM中已经发现新的细菌种类。使用细菌培养和非培养方法发现，葡萄球菌属（Staphylococcus），链球菌属（Streptococcus）和丙酸杆菌属（Propionibacterium）的成员为HM微生物组的主要成分。双歧杆菌属（Bifidobacterium），韦荣氏球菌属（Veillonella），罗氏菌属（Rothia）和乳杆菌属（Lactobacillus）在HM样品中也普遍存在，尽管丰度较低。其他常见的属包括棒状杆菌属（Corynebacterium）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、不动杆菌（Acinetobacter）、食酸菌属（Acidovorax）、假单胞菌属（Pseudomonas）、拟杆菌属（Bacteroides）、梭状芽孢杆菌（Clostridium）、大肠杆菌/志贺氏菌（Escherichia/Shigell）、孪生球菌属（Gemella）和肠球菌（Enterococcus）。虽然个别研究已经报道HM细菌“核心”微生物群含有2-18个分类群，但在不同研究之间往往不同，可能是由于研究方法和研究群体的差异。
HM微生物组与地理和生活方式因素有关，例如农村地区或发展中国家的HM样本比城市或发达地区的样本有更高的细菌多样性。到目前为止，只有一项研究比较HM细菌在人群中的分布。Lackey等人使用16S rRNA基因测序分析来自11个国际站点（位于埃塞俄比亚、冈比亚、加纳、肯尼亚、美国、秘鲁、西班牙和瑞典）的394个HM样本。这项研究的优势在于将同一方法应用于地理和人口不同的人群HM样本。可以反映出HM细菌谱的自然变化/一致性，而不是样品处理过程的差异。作者证明，HM细菌群落在地理位置上各不相同，但都包含核心葡萄球菌属和链球菌属，分别占所有样本的98.7%和97.7%。不论研究人群的人口统计学，地理位置或健康状况如何，这两个属似乎普遍存在于HM中。这一观察结果在最近对HM微生物群的系统综述中得到证实，该综述在12项研究中再次确认葡萄球菌和链球菌是HM微生物群的主要和普遍成员。
双歧杆菌也是一种值得一提的细菌。这个属的成员具有独特的基因可以适应并利用HM中的聚糖作为能源。人类和特定双歧杆菌的共同进化可以追溯到数百万年前。虽然这个属只占HM细菌谱的一小部分，但它在母乳喂养婴儿的胃肠道(GI)微生物群系中占据主导地位，在塑造婴儿GI微生物群系和规划健康方面发挥着重要作用。新出现的证据表明，现代婴儿喂养方式可能导致双歧杆菌属消失。具体来说，缩短母乳喂养时间以及使用婴儿配方奶粉似乎是导致双歧杆菌属失的原因，破坏一种古老的共生关系。鉴于双歧杆菌在婴儿胃肠道中独特而重要的功能，这些细菌的代际传播消失及其影响值得进一步研究。在这个阶段，这个理论的证据仅仅是提示性的，这个假设具有争议。
1.2 病毒
病毒不包含任何普遍保守的基因，使病毒群落分析比细菌分析更加困难。尽管如此，一些研究已经调查HM样本中病毒脱氧核糖核酸（DNA）/RNA的存在，特别强病毒调通过母乳喂养垂直传播。在生命早期，健康婴儿胃肠道中的真核病毒丰富度非常低（从生命的第1-4天开始，每个粪便样本检测到的病毒类群约为0-5）。相反，婴儿的胃肠道噬菌体丰富度在生命开始时最高（从生命第1-4天开始，每个粪便样本的病毒性类群约为40-110），并随着年龄的增长而缓慢下降。噬菌体是感染细菌的病毒。通常对宿主具有高度特异性，在细菌群落动态中发挥重要作用。Pannaraj等人在10对健康母婴中对HM和婴儿粪便中的DNA病毒进行分析。HM和婴儿粪便都被噬菌体强烈控制。婴儿粪便中主要为Siphoviridae，其次为Myoviridae，HM标本主要为Myoviridae，其次为Siphoviridae和Podoviridae。反映了两种环境中细菌宿主范围的差异。Duranti等人专门研究25对母婴双歧杆菌噬菌体的垂直传播。作者在母体粪便，HM和婴儿粪便样本中发现共同的双歧杆菌噬菌体，表明它们是通过母乳喂养垂直传播的。宏基因组学研究已经在健康和与乳腺炎相关的HM样本中确定病毒遗传信息，包括针对假单胞菌，葡萄球菌，肠杆菌和志贺氏菌的噬菌体。有趣的是，在一项对患有和不患有乳腺炎的女性的HM样本的研究中，70%的乳腺炎样本含有噬菌体DNA，而健康女性的这一比例为0%。作者认为这些噬菌体和金黄色葡萄球菌的致病性之间存在潜在的联系。然而，没有数据证明存在已知的噬菌体编码的毒力基因。从HM样品中回收的非噬菌体病毒序列包括Papillomaviridae，Retroviridae和Herpesviridae家族的成员。总的来说，噬菌体和真核病毒似乎都是通过母乳喂养从母亲垂直传播给婴儿，迄今为止HM中的病毒图谱一直严重偏向于DNA病毒。但是，通过HM进行病毒的垂直传播可能对于建立健康的婴儿微生物组发挥重要作用。
1.3 真菌
直到最近，还没有文献记载健康女性的HM中存在真菌和酵母菌。Boix-Amoros等人的两项最新研究表明，在健康女性的大多数HM样本中都存在真菌。通过一系列的方法，包括显微镜、培养、定量PCR和28S rRNA基因测序，作者发现一个低多样性、低生物量、有活力的HM真菌群落。HM样品中的遗传信息以Malassezia为主，其次是Davidiella, Ascomycota, Candida, 和Saccharomyces。像HM微生物组的其他成分一样，虽然在某些情况下似乎存在着由Malassezia和Davidiella spp组成的核心菌群，但该菌群在地理上也有所不同。这可能表明这些类群的传播是HM的保守特征。
Jimenez等人使用鸟枪法宏基因组学研究患有乳腺炎和健康对照的女性HM样本的微生物组。他们在所有健康的和大多数与乳腺炎相关的样本中鉴定了属于Basidiomycota和Ascomycota的真菌序列。有趣的是，在所有健康的HM样本中均检出了典型的皮肤真菌生物组Malassezia globosa物种，但在所有与乳腺炎相关的样本中均未发现该物种，提示乳腺炎可能涉及真菌失调因素。
1.4 古菌
虽然古菌在包括胃肠道和皮肤在内的几种人体栖息地中普遍存在，但是在HM中却没有得到广泛的研究。到目前为止，只有两项宏基因组学研究检测了HM样品中古细菌DNA的存在。Jimenez等人对HM进行宏基因组研究，包括健康女性和患有乳腺炎的女性，他们在健康女性的10个样本中发现8个古细菌DNA，在患有乳腺炎的女性的10个样本中发现0个古细菌DNA。鉴定的物种是 halophilicarchaea Haloarcula marismortui, Halorhabdusutahensis,和 Halomicrobium mukohataei。应当指出，halophilic archaeaHaloarcula marismortui通常需要高盐浓度才能生存，因此它们在HM中的存在值得怀疑。然而，在与乳腺炎相关的样本中没有发现古菌，表明古菌对这些生物具有保护作用。相反，Asnicar等人无法从5对母婴中的HM样品中鉴定古细菌DNA。有趣的是，作者在这些母亲的粪便样本中识别出产甲烷古细菌DNA，但在匹配的HM或婴儿粪便样本中却没有。虽然在HM中古细菌存在的数据是有限的，古细菌的存在已经在牛奶中被描述。牛乳含有一个低丰度、低多样性的古菌群落，这在健康和乳腺炎相关的样本中是不同的。这些数据支持古生菌可能参与HM微生物组并可能与人类乳腺炎有关的观点。需要有针对性的分析来证实这一点。
2.母乳微生物群的功能是什么?
母乳喂养是影响婴儿胃肠道微生物组的主要因素，可能是由于HM微生物的垂直传播，以及存在微生物组形成因素，例如人乳寡糖和抗菌肽等。越来越多的证据表明，HM菌群可在婴儿胃肠道和口腔微生物群中定植。几项研究已经观察到母亲和母乳喂养的婴儿之间共有的菌株。虽然这些菌株可能来自一个共同环境，但这些研究仍然提供通过HM垂直传播的证据。需要进行进一步的菌株水平分析，阐明HM对婴儿胃肠道微生物组的贡献程度以及母婴对之间菌株共享的频率。HM的中性pH有助于HM来源的微生物通过婴儿胃部，可以在喂养期间和之后立即将婴儿的pH缓冲到更高的水平。HM中的非微生物因素，包括不可消化的碳水化合物，例如人乳寡糖，进一步影响婴儿的胃肠道微生物菌群，特别是支持双歧杆菌的生长。虽然双歧杆菌仅占成年人胃肠道和HM微生物组的一小部分，但它们是母乳喂养的婴儿胃肠道微生物组的主要特征。婴儿胃肠道中典型的双歧杆菌种类和菌株很少在环境中发现，因此很可能是从母体来源获得的。确实，有证据表明某些双歧杆菌菌株通过HM从母亲传给婴儿。这些细菌拥有一系列分子工具，使它们能够在从母体到婴儿胃肠道的过程中克服许多挑战。他们利用交叉喂养行为增强他们在母乳喂养的胃肠道环境中的成功定殖。双歧杆菌具有益生菌的潜力，与许多宿主健康有关。因此，母乳喂养可能是母婴传播双歧杆菌的一个重要步骤，可能会带来终身健康益处。
人体胃肠道微生物群在营养、免疫功能、代谢、宿主防御、甚至人类行为和情感等方面发挥着重要作用。早日建立菌群对于后期的健康至关重要。的确，母乳喂养的婴儿发生一系列非传染性疾病（如糖尿病和心脏病）的风险低于配方奶喂养的婴儿。共生细菌赋予婴儿胃肠道有助于免疫耐受和成熟，也有助于肠上皮屏障功能。此外，宏基因组分析揭示母乳喂养和配方奶喂养婴儿的胃肠道微生物群的功能能力差异。母乳喂养的婴儿在碳水化合物、氨基酸和氮代谢、钴胺素合成、膜转运和氧化应激反应方面的能力增强。因此，母乳喂养促进婴儿胃肠道微生物组的组成和功能。
除了细菌，HM在噬菌体直接传播到婴儿胃肠道中发挥作用。考虑到婴儿的适应性免疫反应不发达，这些噬菌体如果是溶解性的，可能在抵抗致病性细菌感染方面起作用。此外，溶解噬菌体可能在管理和控制婴儿胃肠道微生物组的细菌部分方面发挥作用。Lugli等人强调婴儿胃肠道中双歧杆菌和双歧噬菌体之间的动态关系，发现双歧杆菌种类的丰度与相关噬菌体的丰度呈反比关系。这种模式代表了“杀死获胜者”理论的代表，其中最主要的细菌物种被其噬菌体抑制，从而使下一个最主要的细菌物种前进，然后被其噬菌体抑制，依此类推。这种优势细菌和相关噬菌体的通量可能解释早期婴儿胃肠道微生物组的高度动态和不稳定的性质。因此，母体通过HM传播噬菌体可能在塑造婴儿胃肠道微生物组中起关键作用。尽管在早期生命中噬菌体的含量很高，但尚不知道婴儿胃肠道中的溶菌噬菌体水平是否比成人胃肠道中的噬菌体水平升高。
HM菌群的另一个潜在功能是在乳房健康方面。据报道，患有乳腺炎的妇女的HM细菌多样性较低，并且富含潜在病原体。但是，尚不清楚这种减少的多样性是在感染之前发生还是由感染引起。在这个阶段，支持HM微生物群在乳腺炎中作用的假设的证据是不可信的。需要进行动物实验评估乳腺的失调是否会增加患乳腺炎的风险，以及HM微生物群的某些成分是否对这种感染有保护作用。
3.母乳微生物群何时产生?
尽管在哺乳期间HM微生物群的存在有科学共识，目前还不清楚这些微生物群何时被传播，以及在多大程度上，微生物可能会在未怀孕、未哺乳的个体的乳腺组织中定居。
乳腺和导管系统通过乳头暴与外界接触。因此，微生物有可能进入未怀孕、未哺乳个体的乳腺组织。确实，已经在接受乳房手术的妇女的非泌乳性乳腺组织和乳头抽吸液（乳腺上皮细胞分泌物）中鉴定出细菌DNA。虽然这些研究没有根据参与者的平等性对数据进行分层分析，其中包括未生育和一胎多产的妇女，表明细菌DNA可能在第一次泌乳开始之前就存在于乳腺中。这些细菌的DNA图谱随着地理位置和乳腺病理的变化而变化。乳腺组织细菌DNA图谱与HM微生物组有些共同的特征，包括存在葡萄球菌属、丙酸杆菌属、普氏菌属和不动杆菌属。在一项对乳腺组织样本的研究中，可以从所有样本中培养细菌，提示存在活的乳腺微生物组。从乳房组织中共培养出8株:芽孢杆菌、黄体微球菌、痤疮角质层细菌（原痤疮丙杆菌）、颗粒状丙杆菌、葡萄球菌、腐生葡萄球菌、口腔链球菌和无乳链球菌。然而，关于这种细菌的存在是否代表真正的微生物定植，还是仅仅是短暂的存在（即“居民”或“游客”），仍然存在疑问。此外，如此低的生物量样本很容易受到外部污染。非人类灵长类动物的非哺乳期乳腺组织也发现含有细菌DNA。在这些样本中，最丰富的16S rRNA基因序列为HM中常见的属，包括普氏菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和链球菌属。重要的是，这些乳腺细菌的DNA图谱可以通过饮食干预进行调整，表明非怀孕、不分泌乳汁的灵长类动物体内的细菌会从胃肠道转移到乳腺。总之，证据表明细菌在怀孕和哺乳之前就存在于乳腺中。
虽然在泌乳前乳腺中可能存在细菌，但在妊娠末期，母体循环和淋巴系统内流入的细菌可能补充了这些细菌。Perez等人证明小鼠在妊娠和哺乳期肠系膜淋巴结培养的活菌水平显著增加。此外，哺乳期妇女的外周血单核细胞中所含的细菌的复杂性比未怀孕、未哺乳期的对照组要高。这些数据可能表明，在妊娠末期，母体血液和淋巴系统中的细菌运输上调，这一过程可能起到支持HM细菌定植的作用。Ruiz等结合细菌培养法和非培养的技术，证明初乳中存在细菌群落。与非哺乳期乳腺微生物组相比，以葡萄球菌和链球菌为主。出生后，HM微生物组的组成在哺乳过程中发生变化。初乳的细菌生物量比过渡乳或成熟乳低，但多样性较高。典型的肠道细菌水平，如双歧杆菌和肠球菌，在哺乳期增加。这可能表明，在产后从母体消化道的细菌易位继续增加。
综合考虑，证据表明细菌能够在妊娠和哺乳期以外的其他时期进入乳腺组织。该群落可以作为HM微生物组的初始种子。细菌易位在怀孕快结束时增加，可能是第二次接种。然而，一旦母乳进入，HM微生物组的组成似乎改变，可能是由于引入了不同的细菌底物以及初乳中的免疫因子所致。尽管做了这些工作，在这一领域仍有几个未解的问题。例如，第一次妊娠和随后妊娠之间的HM菌群是否有区别?另外，未产和经产妇女的乳腺微生物组是否有区别?如果是，这些因素应考虑到HM微生物组的研究。乳腺微生物群是否以及如何随着青春期、哺乳期、更年期、连续哺乳期、妊娠并发症、疾病和年龄的变化也不清楚。进一步的工作需要确定整个生命周期内乳腺和HM微生物组发育的时间表。考虑到人类寿命研究的困难，动物模型可能有助于回答这类问题。
4.母乳中的微生物群从何而来?
到目前为止，还没有实验证据确凿地证明HM菌群的起源。如上所述，一个先前存在的乳腺微生物组可以作为HM微生物组的初始种子。母体皮肤、婴儿口腔和母体胃肠道也是可能的来源（图2）。因此，HM微生物可能存在多种来源，导致HM微生物组的动态接种。此外，在母乳喂养过程中，由于婴儿口腔和皮肤与母亲乳头的接触，有可能导致母婴之间的微生物双向交换。
4.1 孕产妇皮肤
HM细菌群落通常含有丰富的葡萄球菌属成员，包括人类皮肤共生S. epidermidis, S.hominis, S. haemolyticus,和S. lugdunensis。表皮葡萄球菌是母乳喂养与配方喂养的婴儿的粪便主要区别特征。一项基于培养的HM细菌研究发现，44个HM样本中含有的细菌与从母亲乳头培养的细菌相同。表明母体皮肤微生物群能够通过乳头进入并定居乳腺。或者，母乳皮肤细菌可能会在母乳喂养期间通过直接的皮肤与嘴巴接触定居婴儿。为了研究这种可能性，Pannaraj等对107个健康的母婴对抽取HM，乳晕皮肤和婴儿粪便样本。作者使用V4 16S rRNA基因测序和SourceTracker软件评估这些样品的细菌组成。发现每天摄取超过75％母乳的婴儿从HM中获得27.7％的胃肠道细菌，另有10.3％来自乳晕皮肤。一项研究通过培养在母体粪便，HM和婴儿粪便样本，鉴定出相同的S. epidermidis分离株。进一步菌株水平的工作量化母体皮肤微生物群对HM和婴儿GI微生物群的贡献，可能会为将来的治疗方法提供参考。
4.2 婴儿口腔
如果乳汁从婴儿口腔逆行流向乳腺导管，则可能是来自婴儿口腔的微生物迁移至HM。HM中确实存在口腔细菌，例如： Streptococcus salivarius,Streptococcus mitis, Rothia mucilaginosa,和Gemella spp。Biagi等人对中度早产儿的研究中阐明了这种播种方式。婴儿刚出生时用奶瓶喂母亲乳汁，之后部分婴儿直接由母亲喂养。从奶瓶喂养改为直接母乳喂养后，HM微生物组变得更加多样化，并开始具有婴儿口腔微生物组的特征，包括Streptococcus和Rothia spp含量的增加。表明与婴儿口腔的接触会形成HM微生物组。然而，反过来也可能是正确的：口服HM使其中的细菌传播到口腔。为了支持这一论点，Ruiz等人在妊娠期乳腺分泌物中确定一些典型的口腔共生微生物，并发现在产前分泌物和匹配的婴儿口腔样本之间有很高比例的共享类群。对HM和婴儿口腔样本细菌培养并进行全基因组测序，鉴定出大多数母婴对中>99.9%相似的菌株。这些数据有力地表明，一些HM细菌在婴儿口腔中定居。
4.3 产妇胃肠道
HM微生物群与人类母体GI微生物群有许多共同的特征。HM中鉴定出的主要真菌属之一是酿酒酵母属（Saccharomyces），该属包括成年人胃肠道中一些最丰富的真菌。HM还含有典型的GI细菌，包括Bifidobacterium, Veillonella, Bacteroides, Parabacteroides,Clostridium, Collinsella, Faecalibacterium, Coprococcus,和Blautia。这些严格的厌氧菌不能在母体皮肤上存活，也不能在婴儿口腔中存活。因此，提出肠道-乳腺传播途径解释HM中这些生物的存在。树突状细胞经常破坏肠道上皮并吸收活细菌。这些细胞然后可以将活细菌隔离在肠系膜淋巴结中几天，细菌可能会通过淋巴系统转移到远端。Perez等人在妊娠小鼠肠系膜淋巴结中发现的细菌比未妊娠小鼠多60%，表明在此期间细菌易位增加。此外，在哺乳期间，乳腺组织的淋巴管增多。将两株转基因乳酸菌（乳球菌MG1614和唾液乳杆菌PS2）口服给孕鼠后，在实验组小鼠的乳腺组织和乳汁中检测到转基因乳酸菌，而在对照组小鼠的乳腺组织和乳汁中检测不到。在经过处理的动物的派氏小结细胞中也发现乳酸菌，说明淋巴系统参与这些细菌的运输。尽管树突状细胞可以从肠腔吸收细菌（通过破坏肠上皮细胞之间的紧密连接），但它们到达乳腺组织时的命运尚不清楚。些相同的细胞是否通过乳腺上皮紧密连接来传递细菌？它们是否将树突延伸穿过上皮层以“滴落”细菌？还是涉及非树突状细胞介导的机制？树突状细胞表达紧密连接蛋白，可能使它们穿透乳腺上皮层。然而，未观察到它们与细菌在该界面的相互作用。需要进行细胞培养实验阐明这种情况下起作用的机制。有趣的是，封闭乳腺上皮层的紧密连接在初乳产生期间是开放的—这段时间HM细菌多样性最高。
尚不清楚胃肠道细菌是否以选择性或随机方式转移到乳腺。在细菌组成和丰度方面，HM菌群不能反映母体的胃肠道菌群。实际上，一些常见的GI物种似乎很少进入乳腺（例如大肠杆菌，粪杆菌和真细菌），表明仅允许某些细菌从胃肠道进入乳腺。这种现象可能是由树突状细胞介导的，树突状细胞可以识别某些细菌上存在的表面蛋白，并选择性地使细菌无害地传递至乳腺。迄今为止，尚无研究探讨肠道乳腺接种是选择性过程还是随机过程的问题
Jimenez等人给患有葡萄球菌性乳腺炎的哺乳期妇女每日口服唾液乳杆菌CECT5713和加氏乳杆菌CECT5714，或安慰剂。在治疗30天后，益生菌组妇女的葡萄球菌的计数较低，10例中有6例能从HM样本中分离出益生菌。随后，同一组孕妇给予唾液链球菌PS2或安慰剂预防乳腺炎。益生菌组的乳腺炎发病率约为安慰剂组的一半。可以在益生菌组的29份HM样品中的15份中鉴定出所施用的益生菌菌株，而在安慰剂组中则没有样品。此外，已发现母亲为素食者与母乳喂养婴儿的GI微生物群有关，表明母亲的饮食可能影响HM微生物群。通过更好地理解肠-乳腺通路，可能会发现调节HM微生物组促进母婴健康的机会。
4.4持续的流入还是停留的微生物群?
无论其起源如何，人们对乳腺上皮表面的宿主-微生物相互作用的性质了解甚少。乳腺上皮是分泌屏障表面。然而，关于是否应将其归类为粘膜表面仍存在争议。这对于理解HM微生物群至关重要。有助于理解乳腺是否拥有一个真正和永久的微生物群，或者是否有外源的微生物不断流入（图3）。
恒定流入模型表明，乳腺中没有固定的微生物群，在HM中发现的任何微生物只是“游客”—被外源性力量（如迁移、逆行流和免疫细胞介导的运输）扫进来，然后被挤出的乳汁扫出去。该模型可以解释与体内其他粘膜表面相比，HM中细菌的丰度低。实际上，与GI上皮不同，乳腺上皮并非用于专门分泌粘液。迄今为止，没有实验证据表明细菌粘附在乳腺上皮（乳腺炎之外），也没有细菌在乳腺组织内繁殖。如果恒定流入模型成立，则HM中的细菌很可能处于静态。
粘膜界面模型提示在乳腺组织中存在永久的微生物群。该微生物组的组织方式可能与其他粘膜表面相似，具有居住微生物的分层和分区。如Sakwinska和Bosco所述，HM包含粘膜表面的许多分子属性，例如粘蛋白，高浓度的抗微生物蛋白，免疫球蛋白和多种免疫细胞类型。虽然乳腺上皮细胞不分泌粘液，乳腺可作为粘液样免疫界面。来自牛的研究证据表明，致病性细菌，如金黄色葡萄球菌，能够在乳腺炎环境下在乳腺形成生物膜。然而，乳酸菌也被证明能够附着牛的乳腺上皮细胞形成生物膜，提供预防乳腺炎的保护作用。因此，这些细菌可能能够在体内粘附乳腺上皮细胞。哺乳前乳腺微生物组的证据可能支持驻留微生物组的理论，虽然哺乳期的乳腺微生物群和乳汁微生物群之间的差异可能表明在哺乳期细菌的流入。
5.为什么要研究母乳中的微生物群?
大量研究表明，HM菌群及其代谢物有益于婴儿胃肠道菌群发育、宿主基因表达和免疫发育。纯母乳喂养婴儿的GI微生物组在组成、多样性和功能上与非纯母乳喂养婴儿有显著差异。在一项对900多名婴儿进行的大型纵向研究中，母乳喂养（单独或部分）是影响胃肠道微生物组组成和功能的最重要因素。早期生活是人类微生物组发展的一个关键时期，而早期生活微生物组建立异常与晚年非传染性疾病的发展有关，包括哮喘、过敏、肥胖和神经精神疾病。因此，母乳喂养对预防这类慢性疾病具有保护作用。母乳喂养也有利于产妇健康，减少乳腺癌和卵巢癌、肥胖、糖尿病和高血压的风险。除了保护母婴健康外，纯母乳喂养还带来巨大的全球经济利益。值得注意的是，尽管世界卫生组织指南建议6个月前纯母乳喂养，但只有40%的6个月以下婴儿纯母乳喂养。理解HM微生物群对发育中的婴儿有益的方式，可以定向干预，优化母乳以及供体奶或配方奶中的母乳微生物组。
5.1 HM菌群的调节
各种产妇健康和生活方式因素与HM微生物组的差异有关。包括抗生素的使用，乳腺炎，肥胖，分娩方式，甚至社会模式。有必要重复这些发现，了解母体因素塑造HM微生物组的机制。为我们提供操纵HM菌群以产生有利的临床结果的机会。例如，如果微生物对HM菌群的影响是由饮食引起的，那么可以通过饮食干预改善哺乳期间的HM菌群，优化婴儿胃肠道和口腔微生物组的建立。益生菌是调节HM微生物组以促进乳腺健康以优化早期GI定植的有前途的手段。在小规模的研究中，母体给药的益生菌被用于改变HM菌群和预防和治疗乳腺炎。通过对HM菌群的组成、功能和起源有更深入的了解，可以设计出更有效的益生菌。迄今为止，哺乳期的产妇益生菌疗法仅口服。但是，考虑到孕妇皮肤可能有助于HM微生物组，局部益生菌可能可以有效地塑造HM微生物组。局部益生菌在乳腺炎的情况下可能特别有用，因为与口服益生菌不同，它们可以直接应用于受影响的区域。益生菌对HM菌群的操纵不太可能是一种“一刀切”的方法。相反，益生菌可以基于对母体/HM微生物组的评估而进行个体化，这是一种调节成人GI微生物组的方法。同样，噬菌体疗法可用于修饰HM菌群。尽管噬菌体疗法尚未在人类哺乳环境中进行探索，但它在预防奶牛乳腺炎方面的应用已被广泛研究。在体外和体内，已经对多种噬菌体针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌相关的乳腺炎进行测试，并取得不同的成功。鉴于牛乳房炎发病机制和人类之间存在重叠，有可能将这种治疗应用于人类。
5.2 捐赠母乳的个性化
母乳是早产儿营养的黄金标准；然而，早产婴儿的母亲往往无法生产足够的乳汁满足婴儿的需要。所以，经常喂早产儿食巴氏杀菌的母乳，其不含有任何活的微生物。母乳喂养的早产儿的GI微生物群与供体母乳喂养的早产儿的GI微生物群有所不同，尽管与配方奶喂养的婴儿相比，供体母乳喂养的婴儿的GI微生物群更接近母亲喂养的婴儿。因此，已经尝试通过用少量母乳接种供体乳实现个性化供体乳。Cacho等人用不同量的母乳恢复巴氏灭菌的供体乳，孵育4或8小时。在37℃条件下，用10%母乳与高温巴氏杀菌供体奶孵育4小时，可部分恢复微生物群。个性化的捐赠母乳对婴儿胃肠道微生物群和婴儿健康的影响尚未被测试。尽管可以通过这种方式恢复HM的细菌成分，但不能通过热巴氏灭菌降解HM的其他生物活性成分（包括免疫球蛋白和抑菌蛋白）。紫外线c处理牛奶似乎保留许多丰富的蛋白质和生物活性。因此，用紫外线C处理的牛奶的成分可能会加速细菌再次繁殖。同样，高温短时间巴氏杀菌的HM保留主要的蛋白质，其作用可能类似于紫外线c处理的牛奶。母乳与供体母乳的再融合可以改善早产儿或其他依赖母乳营养的婴儿的健康。
5.3婴幼儿配方奶粉优化
与母乳喂养的婴儿相比，配方奶喂养的婴儿具有明显不同的GI微生物群和健康结果。尽管毫无疑问，母乳喂养是婴儿营养的黄金标准，但并不是所有的妇女都能母乳喂养婴儿。虽然婴儿配方奶粉永远无法模拟HM的复杂性，但有可能确定HM中存在的关键物种对婴儿健康很重要，并选择性地用这些强化配方奶粉。通过这种方式，无法接受HM的婴儿的健康和微生物发展可能得到改善。双歧杆菌可以水解宿主聚糖（人乳寡糖和粘蛋白），使单糖和寡糖可用于GI微生物群的其他成员。为了在配方中利用这些细菌作为益生菌，有必要了解它们的功能作用、营养需求以及在婴儿消化道内的群落相互作用。应该注意的是，单菌株益生菌可能过于简单，无法正确概括类似HM的微生物群，特别是考虑到婴儿胃肠道微生物群的协同作用。配方奶还缺乏塑造婴儿胃肠道细菌种群的噬菌体、碳水化合物和免疫因子。因此，有必要对HM微生物组功能和生态分析。需要进一步的研究表征HM和婴儿胃肠道内的微生物-宿主和微生物-微生物相互作用，更好地支持配方奶喂养婴儿的胃肠道和口腔微生物组的发展。然而，它可以提供有关细胞存活力的数据，并为菌株水平基因组分析铺平道路。
6.如何研究母乳中的微生物群?
细菌培养显示HM含有多种细菌种类。主要是兼性厌氧菌，包括Staphylococcus spp, Streptococcus spp和Propionibacterium spp，还有乳酸菌和严格厌氧菌，例如：Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp.。使用培养可以检测母乳中的活菌。但是，依赖于培养物的分析可能无法检测出细菌，导致低估样品中的多样性。
最近对人体微生物组的研究激增，许多研究用最新的下一代测序方法表征HM微生物组。扩增子测序（例如16S rRNA基因，18S rRNA基因或内部转录的间隔区测序）已允许检测HM中不易被培养检测到的多种微生物，包括严格的厌氧菌，例如梭菌科成员。扩增子测序是一种相对简单，低成本的评估HM微生物组的方法。它还允许检测低丰度的微生物，这些微生物依赖于培养的技术不足以检测。但是，由于这种方法是基于DNA的检测，无法区分活的微生物和死的微生物或游离的DNA。这种限制可以通过与活性染料（如单叠氮丙啶）偶联扩增子测序克服。基于扩增子的工作的另一个复杂之处是它无法产生定量结果。这类工作中使用的通用标记基因，例如16 rRNA基因，在不同细菌物种之间的拷贝数有所不同。这种拷贝数偏差随着聚合酶链反应的每个周期而放大。因此，细菌16S rRNA基因测序研究最多只能提供半定量数据，并且应该与利用单拷贝目标对关键物种进行定量聚合酶链反应相结合。以聚合酶链反应为基础的方法也容易由于引物的选择而产生偏差。由于许多常用的16S rRNA基因引物对双歧杆菌属的覆盖度较低，因此这个问题在该领域尤为重要。此外，该领域基于扩增的研究几乎全部使用短扩增细菌16S rRNA基因测序，这与属水平以外的准确分类学信息的限制有关。鉴于长期的测序技术最近已经降低价格，并将准确性提高到了与短读技术相当的水平，HM微生物组研究将不局限于短扩增子。
最近，已经使用全基因组shot弹枪（WGS）测序方法探索HM微生物组。WGS宏基因组学允许同时检测HM微生物组的所有部分(细菌、病毒、古菌和真菌)，可以提供优于基于短扩增的研究的分辨率，并可以暗示功能能力。此外，HM的WGS测序方法由于HM中人类DNA含量高（所有序列的71％–94％）而变得复杂，可能会限制微生物DNA的测序深度。因此，可以在这类工作中包括一个人类DNA消除步骤。然而，这种类型的分析使人们对HM微生物群落的结构和功能有了更全面的了解。例如，使用WGS测序，Duranti和Milani等观察到双歧杆菌菌株从HM垂直传播至婴儿胃肠道。在微生物生态学的领域内，微生物群落的功能分析越来越受到关注。最近对婴儿GI微生物组进行的研究使用16S rRNA基因测序和WGS宏基因组学（分析组成和暗示功能能力）表明，婴儿胃肠道微生物组具有很高的冗余度（即，个体之间胃肠道微生物组的组成可能有很大差异，但是功能能力得到了保留）。因此，研究HM菌群的转录活性具有重要意义；然而，到目前为止，只有一项这样的研究存在。Asnicar等报道，与HM微生物群相关的最普遍的途径是参与半乳糖和乳糖降解的途径，以及那些参与芳香族化合物的生物合成的途径。由于提取高质量RNA的困难，RNA固有的不稳定性以及与这类工作相关的高昂成本，因此不经常使用元转录组学。研究HM菌群的理想方法取决于所提出的问题。每种方法都有自己的优缺点，因此，方法的组合将提供更多的信息。除了微生物组分析方法外，还缺乏收集、储存和分析HM样本的标准化规程。这些方法的差异使得比较研究结果变得困难。例如，最近的一项研究表明，挤奶的方法（手或泵）可能会影响最终的HM微生物分布。在HM中发现的细菌最初被认为是来自乳腺皮肤或环境的污染物。由于HM中微生物生物量相对较低，HM样品容易受到污染。因此，取样前应对乳头和乳晕皮肤进行消毒，并应在实验台上和数据分析中采用识别和减少用户引入和试剂引入污染的方法。也有证据表明，冷藏牛奶（在冰箱或冰柜中）会降低活细菌的水平。这对许多现有的研究具有启示意义，在这些研究中，样本是纵向收集的，并保存不同的时间。最后，对牛乳的研究表明，某些细菌在脂质和脱脂馏分中含量丰富。因此，由脱脂牛奶或细胞沉淀产生的细菌特征可能无法代表整个HM微生物组。诸如此类的方法障碍需要在HM中更好地定义，以便可以开发标准化协议，从而在该领域具有更高的可重复性。虽然优化方法无法追溯应用到已经处理过的样品中，但是它们可以提高未来HM微生物组研究的质量。
结论
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