科研 | ISME：地下水中迷踪菌比与肠道中迷踪菌更具代谢多样性
编译：小白同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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迷踪菌是一个较新发现的门类，有的存在于动物中，有的独自生活在沉积物、土壤和地下水中。它们之间的代谢能力和进化关系有何差异？
本文分析了94个包含这两种来源的非冗余基因集（其中30个新构建的基因组），共被分为12支，其中10支无参考基因组。地下水中的迷踪菌为异养或自养，依赖于氧气或硝酸盐/亚硝酸盐进行呼吸作用，亦或靠各种有机碳源为生。地下水中两支迷踪菌可以编码一组新的固氮酶旁系同源基因，与S -腺苷蛋氨酸(SAM)自由基共现。细骨菌和黏球菌基因组中发现了与其相似的位点，经预测，该基因簇能够减少四吡咯且可能形成新的辅因子。动物源的迷踪菌在两自然源迷踪菌进化分支之间，因此可以提出一种进化轨迹：某些自然环境中的迷踪菌通过削减基因适应了在动物体内的生活方式。
论文ID
原名：Groundwater Elusimicrobia are metabolically diverse compared to gut microbiome Elusimicrobia and some have a novel nitrogenase paralog
译名：地下水中迷踪菌比与肠道中迷踪菌更具代谢多样性
期刊：The ISME Journal
IF：9.18
发表时间：2020.7
通讯作者：Jillian F. Banfield
作者单位：加州大学伯克利分校
实验设计
结果与讨论
1 非冗余基因集的系统发育分析
基于完整性和污染情况的分析筛选，共得到113个基因组，但其中19个有核糖体蛋白的缺失，因此最终得到94个高质量的迷踪菌非冗余基因集，其中23个来源于动物肠道，71个来自于（多为地下水等）自然环境。进一步对迷踪菌分类，分箱结果中31个属于分支I（Endomicrobia），IIa，IIc，III (Elusimicrobiaceae)，IV，V和VI，涵盖了已知9个区系中的7个，另外10个不属于已定义的物种。将基于16S 的分类和基于蛋白的分类进行比较，发现这94个基因组分属于3个门类，其中89个为迷踪菌门。为厘清分类关系，重构基于蛋白序列的进化树后结果表明，这94个基因组形成了一个类群，为Desantisbacteria和Omnitrophica的兄弟门类，尽管bootstrap算法不足以证明它们之间的亲缘关系是否是最近的。所有肠道源迷踪菌都被归为分支I（Endomicrobia）和III (Elusimicrobiaceae)。Endomicrobia中有3个以前发现的Endomicrobium和1个新的羊胃中的基因组。Elusimicrobiaceae中有Elusimicrobium minutum，多存在于动物中，但有一个来自棕榈油厂废水。其中两个新报道的Elusimicrobiaceae来自于孟加拉和坦桑尼亚人肠道微生物组，与近期相关发现一致：迷踪菌存在于非西方人群肠道中。Elusimicrobiaceae基因组显著小于IV、V和VI，推测可能Elusimicrobiaceae是从其地下水中祖先分支IV、V和VI中由于适应性进化而产生的新物种。94个基因组中没有属于IIb和IId分支的物种，或许是真没有，或许是数据集中的IIb和IId缺少16S序列。22个未被定义物种的Endomicrobia可分为5个区系，其中16个来自地下水样本，6个来自沉积物、油砂和泥炭（图1）。根据当前命名规则将其中三种称为VII (3个基因组), VIII (8个基因组)和IX (6个基因组)，另外5个基因组由于样本量太小未能进行明确分类。IIa, IIb, IIc, IId和IV分支多来自土壤微生物，对于土壤微生物组的分析或可解释为何本研究所得基因集中这些门类较少。
图1 基因组系统发育关系进化树。
2 一种可能参与了辅因子生物合成的新型固氮酶旁系同源基因
有固氮能力的Endomicrobium proavitum能编码不同寻常的固氮酶，属于分支IV（图2）。编码还原酶的nifH通常属于分支I, II和III，通过对NifD氨基酸的分析，表明IVa亚簇中的同系物具有还原酶功能。加上有文献报道过E. proavitum的固氮生物型，无疑分支IV中一些nifH旁系同源基因能编码固氮酶。分支IV中其他一些非IVa亚簇上的nifH蛋白则与辅因子F430的生物合成有关，作为甲基辅酶M还原酶的辅基，在产甲烷最后一步催化甲烷释放。另一个nifH旁系同源基因界定在第V支，与叶绿素生物合成有关。原叶绿素酸酯通过BchLNB络合物转化为叶绿素，其中BchL为NifH的旁系同源基因，BchN和BchB分别为NifD和NifK的旁系同源基因。分支I的两个基因组，RIFOXYA2_FULL_50_26和先前报道的E. proavitum，都含有固氮酶亚基和形成固氮酶所需附件蛋白，RIFOXYA2_FULL_50_26的NifH蛋白或与N2固定有关，其他NifH蛋白都属于分支IV和V且与上述类型不同。相反，22个未被定义物种的迷踪菌中NifH序列自成一派，缺少一些形成固氮酶所需的附件蛋白。这里将其指定为第VI组并推测这些旁系同源蛋白有其独特的尚待发现的生物学作用，这组蛋白包含GXGXXG模块以结合MgATP和半胱氨酸残基。相关的类nifD和类nifK基因已高度分化于固氮酶基因，它们缺少一些保守的半胱氨酸模块。
图2 NifH系统发育关系进化树。
有趣的是，IV组和V组的固氮酶衍生物都通过减少碳-碳双键修饰四吡咯分子。辅因子F430、叶绿素的生物合成涉及到原卟啉等一些来自尿卟啉原III的前体物质。第IV组nifH基因的子集(IV分支的5个基因组)中发现具有产生尿卟啉原III的能力。在Elusimicrobia的其他基因组中虽然缺少一些固氮酶前体生物合成途径，但这并不排除其具有类似功能。分支IV基因组中多为nifK、nifD和nifH多拷贝基因，而分支V基因组中多数亚基为单拷贝。SAM蛋白自由基具有催化甲基化、异构化、厌氧氧化以及辅因子、DNA和抗生素的生物合成等多种功能。不同基因组中编码SAM自由基的基因拷贝数差异很大，从没有该基因到GWC2_Elusimicrobia_56_31基因组中接近固氮酶同源基因的13个拷贝。SAM自由基基因与B12结构域或HemN_C结构域相融合，B12结构域涉及结合钴胺素，而HemN_C结构域被认为与尿卟啉原III氧化酶的底物相结合，两种底物均具有四位基结构，与IV组和V组中NifH相似。最后，利用VI组Elusimicrobia的NifH序列构建了一个隐马尔可夫模型，并在其他基因组中寻找同源序列。结果发现，水生环境中2个Gracilibacteria基因组、14个Myxococcales基因组里找到了VI组NifH的同源序列。这些表明，该酶或许并不发挥固氮作用，而是参与一些类似于叶绿素或F430辅因子的生物合成。
3 迷踪菌及相关基因组的代谢潜能
为进行蛋白组比较，将蛋白序列聚类产生同源蛋白簇6608个，基于基因组信息进一步整合蛋白质家族类别，发现有些蛋白质聚于特定区系，尤其是肠道源的Elusimicrobiacea，缺少很多其他门类中含量丰富的蛋白但含有罕见于其他门类的161个蛋白家族。不同于分支III，分支V基因组较大且编码蛋白较多。总之，蛋白家族与核糖体蛋白系统发育树所定义的谱系一致(来自同一谱系的基因组往往具有相似的蛋白家族)，并可能反映其不同的代谢策略。肠道源迷踪菌具有多种生存策略；而非肠道源迷踪菌具有很强的代谢多样性，既有自养也有异养生活方式（图3），多数都能将糖酵解为乙酸、苹果酸、丁酸或乙醇，通过将底物磷酸化生成ATP；转氢酶(NfnAB)或Bcd/EtfAB复合物等也存在于这些基因组中，这表明它们具有减少自由能浪费和优化能量利用的能力，这种强大的代谢能力不同于那些仅靠发酵获得能量的动物源迷踪菌。
图3 迷踪菌代谢特征分布情况示意图。
迷踪菌分支1和分支2：分析图1中5个ERL1和ERL2的基因组发现所有基因组都缺乏完整的三羧酸循环、NADH脱氢酶和多数氧化磷酸化电子传递链里的复合物。有趣的是，除了一个基因组外，所有基因组都有部分ATP合成酶，所以这个复杂分支的功能仍不明确。本研究中所有基因组都有糖酵解或磷酸戊糖代谢途径，推测也会产生醋酸、乳酸、或氢气等副产物，醋酸激酶和磷酸转乙酰酶可能参与产生醋酸和ATP的过程。因此不能确定它们是否具有功能完整的ATP酶，但它们应该能够通过将底物磷酸化产生ATP。因为发现基因组中有编码淀粉或糖原代谢酶的基因，所以这些生物或许也能够合成储能多糖，推测发酵代谢在Elusimicrobia邻近分支中广泛存在。此前人们一直认为肠道源迷踪菌仅进行发酵代谢，它们的一支祖先为生活在肠道和缺氧土壤、沉积物中的厌氧菌；另一支祖先的[FeFe]氢化酶或可将铁氧化还原蛋白与H2氧化过程结合起来。许多肠道源迷踪菌可以同时产生和利用H2，但其氢化酶类型可能与其他迷踪菌分支有所不同。其中Elusimicrobium minutum Pei191比较特殊，它有4种不同的[FeFe]氢化酶，还有[NiFe]氢化酶，但其他肠道源迷踪菌都没有[NiFe]氢化酶。
地下水中迷踪菌的多种呼吸策略: 氧化磷酸化和三羧酸循环相关编码基因在分支IIa、IIc、IV、V和VI基因组中普遍存在(图4a)。分支V基因组能编码典型NADH脱氢酶和琥珀酸脱氢酶，通过亲和氧的细胞色素氧化酶将电子传递给终端受体氧。与含编码电子传递链相关基因的基因组不同，分支V的基因组都缺乏复合物III (bc1复合物，细胞色素c还原酶)。携带一种或多种bd型氧化酶的生物体通常也拥有至少一种血红素-铜氧还原酶。例如大肠杆菌也缺少复合物III，但携带细胞色素bo3，一种质子泵氧化还原酶。然而，我们没有在V分支基因组中检测到编码细胞色素bo3的基因。由于所有这些生物体都能进行有氧呼吸，本文认为可能有多种方式来替代复合体III或替代物的缺失，因而不能排除这些Elusimicrobia具有好氧电子传递链。来自分支IIa、IIc、IV、VI和VI的几个基因组能代谢多种有机化合物(包括核糖、半乳糖、葡萄糖、醋酸盐，可能还有丙酸和丁酸盐)作为能源和碳源，此外，也能够通过氧化途径代谢脂肪酸，还发现了糖基水解酶可以借助外源糖类来支持生长。事实上，通过编码淀粉、糖原和糊精代谢酶的基因(图4a)，来自分支IIa、IIc、IV、VI和VI的生物或许也能够合成并利用储能多糖。
图4 非肠道源迷踪菌代谢能力，A：分支IV和V，B：分支IX。
氢化酶在分支V中较为集中，而在其他分支中分布稀疏。在一些来自地下水的分支V基因组中，有与Ignavibacterium album和Caldithrix abyssi中氢化酶相关的三聚体氢化酶。Elusimicrobia氢化酶似乎被融合到组氨酸激酶HATPase的结构域中从而实现了对H2的感知功能。此外，这些氢化酶的基因组附近还有Rex等编码蛋白质的调控基因，可以感知NADH与NAD+的比值来进行转录调控。来自地下水的分支V基因组中也有编码各种[NiFe]氢化酶的基因，有7个基因组中有编码可能为双向的[NiFe]氢化酶(也称为巯基氢化酶）。其他四个基因组也含有(甲基还原酶)[NiFe]氢化酶，可能参与了H2的利用，这表明分支V中迷踪菌能感知H2和NADH含量水平，并由此调节相关代谢活动。自然源的分支IIa, IIc, IV和VI(有些有氢化酶，有些则没有)与分支V（都有氢化酶）相比，具有独特的呼吸能力。他们中一些物种氮源利用能力也尤为突出，7个基因组能编码亚硝酸盐氧化还原酶(NxrA）和硝酸盐还原酶，还有一氧化氮还原酶、细胞色素c亚硝酸盐还原酶(NfrAH)及NirK和NirS等，表明这些生物体可以利用硝酸盐进行呼吸作用。这些发现让我们对迷踪菌有了新的认识：从专性发酵到包括利用氧或氮化合物作电子受体等呼吸策略在内的多种生存方式。
地下水中依赖RNF产乙酸的迷踪菌：其他自然源分支VII、VIII和 IX的迷踪菌不能还原氧气或硝酸盐，相反，他们通过WLP通路将CO2还原为乙酰辅酶A以节约能量（图4b）。该通路通常结合细胞色素和醌类来产生膜电位并合成ATP，然而，这些分支中缺少细胞色素和醌。它们编码Rnf复合物（一种钠驱动的铁氧化还原蛋白：NAD+氧化还原酶），这种物质可以在醋酸杆菌细胞膜上产生钠离子电位。这些结果表明，分支VII、VIII和IX迷踪菌能够以氢和二氧化碳为底物自养生长。分支VII、VIII、IX、ERL2和少量分支I的迷踪菌含有[NiFe]氢化酶，这种氢化酶和Rnf复合物都将离子排出并产生膜电位，这些分支被预测为产乙酸菌，它们这种生活方式此前未曾在迷踪菌门中有所报道。
结论
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