科研 | Nature子刊：抗生素导致的微生物损耗改变了机体代谢稳态
本文由卡内斯坦编译，董小橙、江舜尧编辑。
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抗生素诱导的微生物组耗损（AIMD）对正常小鼠代谢稳态的影响目前研究尚少。本文作者通过严格的对照试验，系统评价了AIMD对肠道微生物组、代谢物、代谢信号分子和转录组的影响。
论文ID
原名：Antibiotic-induced microbiome depletion alters metabolic homeostasis by affecting gut signaling and colonic metabolism
译名：抗生素造成的微生物组耗损通过肠道信号和结肠代谢通路改变机体代谢稳态
期刊：Nature Communications
IF：12.353
发表时间：2018年
通信作者：Amir Zarrinpar and Satchidananda Panda
通信作者单位：Regulatory Biology Laboratory, The Salk Institute, 10010 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA
实验设计
作者将正常喂养的C57BL/6小鼠分为两组，一组进行AIMD处理，每日两次通过管饲法喂食青霉素、万古霉素、甲硝唑、新霉素和两性霉素B；另一组为对照组，管饲法喂水。在处理前后分别对小鼠体重、食物消耗、身体组分、粪便、血液进行分析，并在处死小鼠后对对小鼠组织进行重量测定、组织学分析、转录组学分析。从而明确AIMD对小鼠肠道微生物群、肠道信号转导和代谢的影响。
实验内容
实验1：AIMD影响肠道微生物组的结构和功能
AIMD组小鼠的粪便产量高于对照组，但粪便培养物中的菌数量（CFU）远低于对照组。就粪便提取获取的DNA量，AIMD组只有对照组的二十分之一。另外，AIMD小鼠的盲肠重量高于对照组。微生物组学分析显示，处理前和对照组小鼠都以Firmicutes和Bacteroidetes为主；而AIMD组以Proteobacteria为主，Firmicutes和Bacteroidetes较少。处理前和对照组的OTUs基本相同，而AIMD的OUTs数量只有它们的六分之一。菌群的α多样性（系统发育多样性）和β多样性（UniFrac距离）分析显示，对照组稍低于处理前，而AIMD组显著低于处理组。基因功能预测分析显示，AIMD组和对照组之间的多数差异都存在于代谢通路方面，特别是脂质代谢（包括刺激胆汁酸合成）。（图1）
综上，AIMD处理导致小鼠肠道微生物组耗损（特别是Firmicutes和Bacteroidetes）、微生物多样性降低，还改变了微生物组的潜在生物功能。
图1 AIMD导致肠道微生物组耗损
实验2：AIMD提高糖稳态
禁食4或16小时后，AIMD组小鼠空腹血糖水平低于对照组，且AIMD组小鼠血糖消耗较快。胰岛素耐量测试显示，AIMD组小鼠对胰岛素敏感性提高；两组小鼠的空腹胰岛素水平无显著差异。AIMD未影响小鼠体重、身体组成成分和累计饲料消耗量。（图2）
综上，AIMD降低空腹血糖水平、提升糖耐和胰岛素敏感性。
图2 AIMD提高糖耐和胰岛素敏感性
实验3：AIMD改变肠道次生代谢产物
AIMD能够影响肠道次生代谢产物和肠道信号转到，进而影响全身糖稳态。与对照组相比，AIMD小鼠粪便中丁酸完全消失、丙酸浓度显著降低。即AIMD改变了短链脂肪酸（SCFAs）含量。另外，AIMD还显著改变了粪便胆汁酸含量。AIMD小鼠粪便中很多初级胆汁酸（BAs）和刺激胆汁酸的浓度较低。AIMD小鼠粪便中初级胆汁酸和次级胆汁酸的比例较对照组小鼠高20倍。（图3）
综上，AIMD显著改变肠道SCFAs和Bas。
图3 AIMD影响粪便SCFAs和BAs含量
实验4：AIMD改变肠道代谢信号
因肠道次生代谢产物会影响肠道稳态和信号转导，作者对肠道相关激素和代谢相关重要激素的变化进行分析。首先分析的是调节血糖的肠促胰岛素，胰高血糖素样肽1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌肽（GIP）。AIMD小鼠的GLP-1显著高于对照组，高达18倍。尽管两组小鼠禁食胰岛素水平无差异，但重新喂食后，AIMD小鼠的胰岛素显著高于对照组。GLP-1可能是背后的原因。盲肠转录组分析显示，GLP-1的编码基因在AIMD小鼠中显著高表达。另外，辅助GLP-1产生的蛋白酶Pcsk7表达水平也提高，但负责GLP-1蛋白降解的酶无明显变化。两组小鼠GIP表达水平无明显差异。其他代谢相关激素分析显示，AIMD小鼠的瘦素和胰高血糖素都升高，饥饿激素（ghrelin）无明显差异。AIMD小鼠与无菌小鼠相比，有以下共同点：GLP-1水平升高；禁食胰岛素和GIP水平无明显变化。与AIMD小鼠不同的是，无菌小鼠高血糖素和瘦素相较对照无明显变化，而饥饿激素降低。（图4）
图4 AIMD提高GLP-1水平并影响其他激素水平
机制研究显示，尽管GLP-1的拮抗剂能够提高AIMD小鼠血糖升高幅度，但无法达到与拮抗剂处理的对照组小鼠类似的水平。因此，GLP-1并不是AIMD小鼠血糖降低的唯一因素。
实验5：AIMD改变盲肠上皮细胞转录组
盲肠转录组分析显示，AIMD小鼠和对照组小鼠存在6265个差异表达的基因。Ingenuity通路分析显示，差异表达基因主要与线粒体功能障碍和氧化磷酸化通路有关。另外，与AIMD小鼠盲肠增大相一致，细胞生长、增殖、死亡和存活相关的分子也存在差异。AIMD小鼠的炎症信号分子表达也发生改变。但有的促炎症分子升高（如IL-18）有的降低（如IL1rm），因此无法确定AIMD对小鼠炎症的确切影响。（图5）
图5 AIMD使盲肠转录组发生巨大变化
综上，AIMD不仅影响盲肠细胞代谢，还影响肠道细胞增殖和炎症信号。
实验6：AIMD改变盲肠上皮细胞代谢
为了对AIMD糖稳态的变化有更好地了解，作者对转录组中代谢相关基因进行深入分析。肠道SCFAs减少表明，肠道吸收脂肪酸能力下降。基因分析显示，AIMD小鼠的脂肪酸代谢相关的基因都被下调，包括脂肪酸的受体（如Ffar2、Gpr41和Fabp2）、转运体（如Cpt1a、Cpt2和Acss1）以及负责脂肪酸β氧化的酶类（如Acadl、Echdc2和Hadh）。因此，肠道细胞很难再将SCFAs用作能量来源。分析显示，肠道细胞也不太可能将SCFAs加工成脂肪用于储存。因为脂肪合成相关的多个酶类（Fasn和Scd1）被下调。为了获得能量，肠道细胞可能用酮体替代SCFAs。相关的证据是Oxct1上调而Acot7和Hmgcs2等下调。（图6）
图6 AIMD小鼠盲肠细胞的无氧酵解上调
盲肠转录组分析显示，AIMD小鼠的无氧酵解被上调而糖异生被抑制。一方面无氧酵解相关的10个酶类中的8个（Hk2、Pfkp、Aldob、Pgk1、Pgam1、Eno1、Pklr和Ldha）被上调，将糖类转运至酵解部位的蛋白（如Gyk和Gpd2）也被上调；另一方面糖异生相关基因（如Pck1和Crtc2）被下调。另外，负责钠钾转运的ATPase上调、负责糖类外排转运的蛋白Slc50a1也被下调。这表明，肠道细胞的能量供应更依赖于糖的无氧酵解，而不是线粒体。与此相一致，细胞内线粒体数量减少。AIMD小鼠的线粒体基因组M的读数低于对照组小鼠；线粒体细胞色素b和细胞色素C的部分亚单元在AIMD小鼠中显著下调。
肝脏是机体糖稳态的重要调节器官。通过qRT-PCR对肝脏糖代谢相关蛋白的表达进行分析发现，与肠道不同，AIMD小鼠的肝脏糖异生相关蛋白（Pcx和Pgc1a）被上调、肝脏葡萄糖转运蛋白2（Glut2和Slc2a2）被上调，而葡萄糖激酶被下调。肝脏组织学特征、甘油三酯含量以及脂类代谢相关蛋白（Pparα和Rev-erbα）未受AIMD影响。
综上，盲肠转录组分析发现，AIMD处理后小鼠肠道细胞用葡萄糖替代SCFAs作为能量来源，葡萄糖的无氧酵解上调，糖异生和线粒体的功能下调。而肝脏中，跟受到饥饿刺激一样，糖异生上调、糖酵解下调。
实验7：AIMD改变胆汁酸代谢、增强GLP-1应答
因AIMD小鼠的肠道BA含量也发生了显著变化，作者对盲肠细胞的BA代谢相关基因也进行了深入分析。负责肠道BA吸收的转运蛋白Slc10a2/Ibat上调，负责将BA从肠道细胞转运至肝肠循环的转运蛋白Slc51b/Osbt也上调。能够激活以上两种转运蛋白的FXR上调，与FXR形成异源二聚体的RXRa也上调。因此可认为，是上调的FXR信号促使肠道细胞大量吸收BAs。（图7）
图7 AIMD因改变BA代谢增强GLP-1应答
既然肠道对BAs吸收增加，作者进一步对血液中BAs含量进行分析。AIMD小鼠血液中初级BAs显著提高，次级BAs仍是对照组小鼠中较高；初级和次级BAs比值，AIMD小鼠比对照组高十倍。但血液中胆固醇和甘油三酯浓度未发生显著变化。对肝脏中BAs代谢相关的关键酶的表达水平进行分析发现，肝脏BA转运蛋白Slc10a1/Lbat上调，促进BAs合成的介导分子Nr0b2/Shp下调，促进肝脏BAs合成的Cyp7a1上调三倍。但肝脏FXR表达水平并未发生显著变化。
作者接下来分析肠道BA是否影响糖稳态和GLP-1水平。喂食正常小鼠FXR激动剂TCA（AIMD小鼠中TCA升高）四天后，GLP-1显著升高，而禁食后血糖逐渐降低。胰高血糖素、胰岛素、瘦素、饥饿激素和GIP都未发生明显变化。
综上，由于AIMD小鼠中肠道BA浓度降低，盲肠细胞为维持原有BA吸收量，上调FXR和BA转运蛋白的表达。作为FXR拮抗剂的初级/结合BAs被转运入血液中后会抑制Shp，从而上调肝脏中BAs的合成。同时，肠道中TCA升高促进血液中GLP-1增加，可能是肠道BAs变化影响糖稳态的一个机制。
讨 论
AIMD是肠道次生代谢物发生显著变化，其中SCFAs和BA进而影响肠道信号通路。因为肠道可提供的丁酸减少，肠道细胞用葡萄糖替代它作为能量来源。这导致整体的糖稳态发生变化，血糖降低、胰岛素敏感性增加以及肝脏糖异生增加。同时可能由于肠道初级BA增多（如TCA），GLP-1升高。AIMD还导致肠道对BA吸收增加，进而使血液BA浓度升高，通过FXR信号转导肝脏BAs合成量增加。
评 论
本研究从肠道菌群、代谢物和肠道信号分子表达等三个层面对AIMD动物模型效应进行了系统分析。