科研 | Food Microbiology ：冷藏条件下苜蓿和绿豆芽细菌群落的动态变化
本文由沐秋编译，十九、江舜尧编辑。
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本研究旨在阐明在冷藏条件下储存期间，芽菜相关的细菌群体随时间的变化趋势。对两个市售品牌的新鲜苜蓿和绿豆芽进行了微生物质量检测，APC数目分别为苜蓿5.0～8.7 log CFU/g,绿豆6.7～9.3 log CFU/g。两个苜蓿品牌之间的平均APC数量存在差异。大肠菌群的数量在紫花苜蓿中为4.3～7.7 CFU/g，绿豆芽中为4.1～8.1 CFU/g。提取四个独立批次的芽菜的DNA，并利用16S rRNA扩增子序列测定了微生物群落。苜蓿芽在整个贮藏过程中以假单胞菌为主，在3周的时候相对丰度大于60%。鲜绿豆芽以假单胞菌和泛菌为主，经2周贮藏后，泛菌成为优势类群，相对丰度>46%。与芽菜有关的细菌群落主要取决于芽菜的类型，而与生产环境相关性不大。物种丰富度和多样性随着储存时间的延长呈下降趋势。在已鉴定的160属中，23属含有已知的腐败伴生种，30属含有潜在的人类致病种。本研究为紫花苜蓿和绿豆芽在冷藏过程中的微生物群落动态变化提供了新的认识。
论文ID
原名：Dynamics of bacterial communities in alfalfa and mung bean sprouts during refrigerated conditions
译名：冷藏条件下苜蓿和绿豆芽细菌群落的动态变化
期刊：Food Microbiology
IF：4.089
发表时间：2019
通信作者：Shlomo Sela Saldinger
通信作者单位：以色列微生物食品安全研究单位食品科学部
实验设计
1 样品采集和处理
200克紫花苜蓿和绿豆芽购于以色列Rishon-LeZion市的零售商处，各购买两个品牌，在半小时内在冷藏条件下运送到实验室。无菌条件下打开豆芽包装，称取25g的样品并在225ml缓冲的蛋白胨水（BPW; Becton Dickinson，Sparks MD，USA）中匀质化2分钟。紫花苜蓿的保质期为苜蓿3周，绿豆芽2周。在不同时间取样并提取DNA用于微生物分析。
2 细菌学分析
使用Plate Count Agar（Becton Dickinson）进行APC测定。将平板在35℃温育48小时，并计数细菌菌落。使用紫红色胆汁琼脂（VRBA; Becton Dickinson）进行大肠杆菌测定并计数典型的大紫红色菌落。在胰蛋白胨胆汁X-葡糖苷酸（TBX）琼脂（Merck，Darmstadt，Germany）直接接种来测定大肠杆菌。将板在44℃下孵育20小时，计数蓝色菌落。单独的芽菜包装用于检测沙门氏菌和李斯特菌。
3 DNA提取和16S rRNA测序
使用Mericon DNA细菌试剂盒（Qiagen，Germany）提取DNA，使用NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific，USA）检查纯度，并在-20℃下储存。每个处理三个重复。使用引物515F和806R进行PCR扩增以扩增细菌16S rRNA基因序列的V3-V4保守区域。使用两步法靶向扩增子测序扩增基因组DNA。
4 测序数据分析
使用Mothur软件进行序列处理。将高质量序列与Mothur版本的SILVA细菌参考序列比对。鉴定每个样品中的独特序列及其频率。根据关于腐败微生物的公开文献确定与食品腐败有关的属。根据最新版“临床微生物学手册”中列出的医学上重要的细菌属，确定潜在的人类致病属。归一化每个样本中的序列数量，评估多样性。
5 与芽菜相关的细菌群落的功能分析
使用PICRUSt（版本1.0.0）对群落进行系统发育研究，用于预测基于与芽菜样品相关的细菌群落的16S rRNA基因序列的功能分析，生成预测的KEGG通路。使用STAMP（v.2.0.9）分析不同品牌和储存时间之间细菌群落的显著预测功能差异，并可视化。
结果
1 芽菜的细菌学评价
如表1所示，APC数目在苜蓿中为5.0-8.7 log CFU/g，在绿豆芽中为6.7-9.3 log CFU/g。苜蓿品牌c1的平均APC数量（7.53±0.15）高于c2（8.1±0.07）。大肠杆菌的数量在苜蓿中为4.3-7.7 log CFU/g，在绿豆芽中为4.1-8.1 log CFU/g。与c1相比，两种类型的芽菜在c2中含有更高的大肠菌数。在由同一制造商生产的两个芽菜品牌之间，平均大肠菌数没有显著差异。在60个芽菜样品中仅有1个检测到大肠杆菌。
2 冷藏期间物种的丰富度和多样性
在芽菜不同取样时间点，16S rRNA基因的配对末端测序每个文库产生超过13,000个有效序列（除了一个苜蓿样品（3周，仅产生248个序列），将其从下游分析中除去）。将这些有效序列标准化以用于分析多样性指数。总体而言，它们聚集成1,375个OTU，相似性为97％，在品牌c2的苜蓿样品中观察到最高的多样性指数（表2）。所有的稀释曲线都达到饱和（数据未显示），测序深度足以覆盖整个细菌多样性。另外，所有样本的覆盖率均> 99％。
观察到的OTU的数量在样品之间有所不同，并且在来自品牌c2的苜蓿样品中观察到最高数量的OTU。由Chao估计的c2品牌的苜蓿物种丰富度为613，而来自c1品牌的苜蓿则为363，来自c2品牌的绿豆中为234，来自c1品牌的绿豆中为167，表明c2品牌的苜蓿芽具有最大的物种丰富度。来自c2品牌的苜蓿的Shannon多样性指数也最高（平均值= 2.34），来自c2品牌的绿豆的Shannon多样性指数最低（平均值= 1.35）。此外c1品牌的苜蓿和绿豆的平均Shannon多样性指数分别为1.82和1.39。Shannon均匀度指数显示，与绿豆芽相比，OTU在苜蓿芽中分布更均匀。
NMDS用于将每个样品降维映射至纵坐标，以确定与芽相关的细菌群体的细菌群落相似性。基于加权unifrac得分的二维NMDS足以解释群落差异（压力值= 0.05，r2 = 0.98）（图1）。属于紫花苜蓿和绿豆的豆芽样品彼此明显地分开。与绿豆相比，属于两个不同品牌的紫花苜蓿样品更加分离，绿豆彼此接近。ANOSIM证明了芽苗类型（R = 0.68，p <0.001），不同苜蓿品牌（R = 0.56，p <0.001）和不同绿豆品牌（R = 0.29，p <0.001）之间细菌群落组成的统计学显著差异。来自各品牌的重复的细菌群落组成以及随后的储存周数没有显著差异（p > 0.05）。
图1 NMDS图显示与4°C冷藏期间苜蓿和绿豆芽相关的细菌群落组成。黑色和蓝色圆点分别表示来自品牌c1和c2的苜蓿的细菌群落组成; 黑色和蓝色方块分别表示来自品牌c1和c2的绿豆的细菌群落组成。0w，1w，2w，3w分别表示储存周数，其中苜蓿为0w-3w，而绿豆芽为0w-2w。每个样品重复四次。
3 购买时与苜蓿和绿豆芽相关的细菌群落组成
紫花苜蓿和绿豆芽中的细菌群落组成由12种不同的门和未分类的细菌成员组成。总的来说，来自两种芽菜类型的序列可分为18个纲，43个目，68个科和160个属。在160个观察到的属中，56个占整个序列的0.01％以上，25个以> 0.1％存在，仅10个属占所有序列> 1％。苜蓿中含有154个不同的属，而绿豆芽只有85属。在购买时，来自品牌c2的苜蓿和绿豆芽的微生物种群比来自品牌c1的芽菜多样性更高（表1）。来自品牌c2的苜蓿含有107个属，而品牌c1中只有53个。同样，品牌c2的绿豆芽含有61个属，而品牌c1含有36个。
购买时苜蓿和绿豆芽中最丰富的是变形杆菌门。苜蓿品牌c1和c2中变形菌的相对丰度分别为98.5％和97.3％，绿豆芽品牌c1和c2中的变形菌相对丰度分别为99％和91.7％。厚壁菌门为第二丰富的门类，其中苜蓿品牌c1和c2的厚壁菌门相对丰度分别为1.3％和2.1％，绿豆品牌c1和c2分别为0.74％和8.1％。其他10种菌门，即疣状杆菌，蓝藻，拟杆菌，放线菌，衣原体，Deferribacteres，Marinimicrobia（SAR406_clade），嗜酸杆菌，Planctomycetes，TM6（Dependentiae）等，以相对丰度小于0.1％表示。
本研究分析了芽菜类型和不同品牌在科水平的变化情况（图2a）。属于假单胞菌属的变形菌种是苜蓿中（品种c1为48.8％，c2 为29.5％）和绿豆芽的品牌c1中（36.4％）最丰富的，而泛菌在绿豆芽c2品牌（33.5％）中含量最高。此外，苜蓿品牌c1中富集Janthinobacterium（9％），品牌c2中富集Duganella（5％），而不动杆菌是绿豆两个品牌中第三丰富的种（品牌c1和品牌中分别为15.9％和9.1％）。
图2 （a）购买时主要科水平的相对丰富度，（b）购买时和冷藏条件下的优势属。
4 冷藏期间细菌群落组成的变化
在冷藏期间，观察两种类型的芽菜和不同芽菜品牌的优势属的丰度变化（图 2b）。在苜蓿贮藏的第一周，假单胞菌在品牌c1和c2的相对丰度分别增加为56.8％和46％。假单胞菌的数量在连续几周内增加，并且在3周时超过60％（品牌c1为61％;品牌2为64.4％）。第二丰富属，泛菌在冷藏期间减少，在3周后，品牌c1和c2中分别达到6.2％和3.2％。Janthinobacterium在c1的丰度保持不变（0w为9.7％，3w后为10.4％），而c2略有下降（3w后从2.3％降到1.4％）。在储存3周后，两种品牌的Duganella和不动杆菌均下降（图 2b）。
相比之下，绿豆贮藏1周后，泛菌丰度增加，成为最具优势的菌种，分别占品牌c1和c2的43.8％和40.5％。储存2周后泛菌的丰度进一步增加（分别为50.4％和46％）（图 2b）。假单胞菌是绿豆中第二大优势属，其丰度在品牌c1中2周后降低，但在品牌c2中在2周后增加至21.2％。在两个品牌的绿豆芽中，不动杆菌的丰度在储存2周后降低。
5 与腐败相关的属
根据已发表的文献，在与豆芽相关的160个属中，有23个被鉴定为腐败相关属。腐败菌包括丰度高的菌属，如假单胞菌和泛菌，以及另外21种丰度不太高的属，其中包括明串珠菌，欧文氏菌，果胶杆菌，黄单胞菌，黄杆菌等。这些属中的相对丰度在储存期间增加，而一些仅出现在存储期间，且不遵循任何常规模式。
6 与芽菜相关的致病性和潜在致病属
在冷藏期间，含有人类致病物种的一些菌属的丰度增加，而少数具有潜在或概率性人类病原体的菌属在储存期间降低至低于检测限。在与芽菜样品相关的总共160个属中，确定了30个，包括概率性致病种，来自医院的或已知的人类致病物种。其中一些菌属在新鲜样品中未检测到，但仅在冷藏期间出现。例如，克雷伯氏菌，链球菌，Routella，沙门氏菌等。值得注意的是，食源性病原体沙门氏菌不到两周时在紫花苜蓿（c2）中检测到，但在储存三周时只检测到低丰度（0.004％）的食源性病原体沙门氏菌。
7 芽菜细菌群落的预测功能
关于芽菜相关微生物组的知识可以揭示相关的代谢功能。通过PICRUSt分析微生物组数据，并使用KEGG同源性预测总共294个代谢通路。使用PCoA图（图3）分析了源自预测的代谢通路的所有潜在功能，其揭示了与绿豆芽相比，与苜蓿相关的不同功能。在PICRUSt鉴定的5,708种描述性预测功能中，有64种与腐败酶有关。这些酶可分为7种主要类型的腐败相关酶，例如果胶分解酶，淀粉酶，醇脱氢酶，脂肪酶，脱羧酶，脱氨酶和乳酸脱氢酶。
总体而言，两种芽菜中最富集的预测通路包括转运蛋白（10.51％;包括4.03％的ABC转运蛋白），特征不良的通路（3.58％），双组分系统（2.7％），分泌系统（2.3％）和DNA修复和重组蛋白（2.13％）。其次（2％-1％）有细菌运动蛋白，嘌呤代谢，转录因子，肽酶，核糖体，离子偶联转运蛋白，精氨酸和脯氨酸代谢，氧化磷酸化，嘧啶代谢，核糖体生物发生，氨基酸相关酶，伴侣和折叠催化剂，以及未分类通路等（补充材料，表S4）。与绿豆芽相比，苜蓿中显著更高的主要代谢通路是氨基酸，脂类能量，萜类化合物和聚酮化合物的代谢，次生代谢物的生物合成，异生素的代谢和生物降解。其他功能如苜蓿芽中的孔隙离子通道（细胞过程和信号传导），细胞运动性（细胞过程）和转录（遗传信息处理）等，相比之下也更高。与苜蓿相比，绿豆中的一些主要代谢通路显著更高，例如酶家族，辅因子，维生素，聚糖和核苷酸的代谢。膜转运（环境信息处理），折叠，分选，降解和翻译（遗传信息处理）等其他功能在绿豆芽中也很高（图4）。
图4 基于16S rRNA基因序列，使用PICRUSt预测微生物群落的功能分析
讨论
豆芽中含有最多的好氧嗜温细菌，研究显示，APC在各种芽菜中的范围为6-11 log CFU / g。本研究中，我们发现紫花苜蓿的APC范围为5.0-8.7 log CFU / g，绿豆芽中的APC范围为6.7-9.3 log CFU / g。品牌c1紫花苜蓿的平均APC高于c1绿豆芽中的平均APC。在本研究中，只有一个样本含有大肠杆菌且不含沙门氏菌或李斯特菌。尽管许多研究报道了大肠杆菌的存在以及少量的沙门氏菌和李斯特菌的存在，尚未有报道发现有病原体。
考虑到可培养细菌仅占整个微生物群体的一小部分，芽菜的消耗与细菌的高摄入有关。研究表明植物的物种是决定芽菜微生物组成的主要因素，而生产环境似乎不太重要。说明不同种植者在不同地理区域生产，并在不同的商店购买的四种不同苜蓿芽样品的微生物组中的显著相似性。同样，群落水平的生理分析表明，芽菜类型中微生物群落的变异性比芽菜生长设施和种子批次更广泛。来自不同品牌的芽菜群落结构的变化可归因于生长过程的变化，包括使用的水源，以及不同的包装和运输条件。
与绿豆芽相比，紫花苜蓿芽中的细菌群落多样性更高（图2），OTU丰富度也更高（表1）。与叶菜的叶际菌群相比，本研究中以及在其他研究中发现的与芽菜相关的微生物组显示出相对有限数量的OTU，其物种多样性较低。这可能是因为，与绿叶蔬菜的土壤相比，芽菜的微生物群的潜在来源有所不同，例如使用无土壤生长环境的干燥种子和灌溉水。
在本研究中，假单胞菌科是紫花苜蓿中最具优势的菌，在绿豆芽中属于第二大优势菌（图2a）。假单胞菌属是发现于土壤中腐生物种的高度异质组，含有植物，动物和人类中有机物分解，和植被的概率病原体。有报道称假单胞菌科成员在RTE萝卜芽中非常丰富，而在苜蓿，绿豆和花椰菜芽中，在无菌生长和商业种植的芽菜中的丰度存在显著差异。因此推断萌芽环境（如灌溉水）可能会影响相关的微生物组。一些物种，例如荧光假单胞菌和绿色假单胞菌可以在4°C或更低的温度下引起植物组织的腐烂，因此这些菌种和其他嗜冷物种在苜蓿和绿豆芽在4°C储存期间有可能会导致芽菜的腐败。
据报道，肠杆菌科在新鲜农产品中以及贮藏期间含量极高。肠杆菌科含有已知的腐败相关属。在本研究中，肠杆菌科丰度位于第二，购买时苜蓿占28.1％，绿豆占53.1％。冷藏3周后，其在苜蓿中的相对丰度降至15.2％，而绿豆在2周保质期后肠杆菌科丰度则增加至62.3％。在模拟冷藏期间，绿豆芽的保质期较短可能是由腐败引起的肠杆菌科细菌的增殖引起的。引起腐败的的潜在菌属也可能是泛菌。据报道泛菌在新鲜绿豆芽（57.5％），菠菜（32.5％）和胡椒（11.5％）中含量非常丰富，且会导致植物性食物腐败。绿豆芽中的泛菌丰度在2周的贮藏期间分别增加到品种50.4％（c1）和46％（c2），这一现象证实了泛菌在绿豆腐败中的作用。
了解食物储存过程中的微生物演替在经济上具有重要意义。在两种芽菜储存期间，整体细菌多样性降低。在4°C和10°C至15天的储存期间，菠菜的叶际群落也有类似趋势。事实上，已有报道提出腐败过程与几种食品中细菌多样性的减少有关。冷藏过程中的微生物演替在其他食品中已有研究。前人对芽菜的研究基于DGGE分析了从购买时到7天的微生物群落演替，并使用16S rRNA测序分析了长达12天的微生物演替情况。本研究首次报道了使用基于二代测序的方法在冷藏保存期间芽菜的微生物演替。
在冷藏保存的菠菜的情况下也观察到细菌多样性和物种丰富度的降低。在细菌多样性和物种丰富度降低后，冷藏期间沙门氏菌也出现在苜蓿中。在冷藏条件下储存导致对嗜冷菌类群的温度依赖性选择，例如假单胞菌，泛菌，明串珠菌，欧文氏菌，Rahnella等。冷藏后的蔬菜中也报道了高丰度嗜冷菌的存在，特别是假单胞菌，泛菌，欧文氏菌，Rahnella和乳酸菌等。许多这些嗜冷菌与新鲜蔬菜的腐败有关。明串珠菌属是保质期结束（即在4°C冷藏一周后）时RTE沙拉中最主要的种群。在两个品牌的绿豆芽中也观察到冷冻保存两周后明显的明串珠菌丰度增加，这也进一步印证了其在芽菜腐败中的潜在作用。
为了了解与细菌腐败相关的潜在功能，我们使用PICRUSt分析了数据。使用基于分类学分析的KEGG预测与腐败相关的酶（补充材料，表S3）。实际上，在两种芽菜样品的预测结果中出现了果胶甲基酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶，三种参与果胶链解聚的酶。购买时这些酶的丰度在绿豆芽中比苜蓿芽更高（补充材料，表S3）。这些发现可能解释了为什么与苜蓿芽相比，绿豆的保质期更短。
两种芽菜中最丰富的预测蛋白质属于“环境信息处理”功能，并且由转运蛋白，ABC转运蛋白和双组分信号转导系统组成。这些特征使细菌能够感知，响应并适应芽菜环境中的动态变化。值得注意的是，第三富集的功能（补充材料，表S4）是“特征不良”。该组中的蛋白质可能在芽的定殖和恶化中的作用尚属未知。
两种芽菜类型中乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的存在表明，腐败也是通过厌氧过程进行的。明串珠菌属的物种可以将碳水化合物代谢成乳酸，乙醇和CO2或乙酸，乙偶姻，二乙酰和CO2。肠杆菌科的成员与新鲜农产品的发酵有关，从游离氨基酸形成具有脱羧酶活性的生物胺。在两种芽菜样品中预测了几种氨基酸脱羧酶和脱氨酶，表明蛋白质物质的分解。还在两种芽菜中预测了微生物脂肪酶，表明芽的微生物群落的潜在脂质降解活性。总体而言，与腐败有关的预测酶类经过储存后在苜蓿芽中减少，而在绿豆芽中下则增加，这也进一步证实了我们关于绿豆芽的较短保质期的原因推断。
芽菜微生物组还可能含有潜在的或概率性的人类病原体，这可能对易感人群有害，如免疫功能低下人群，幼儿，老年人和孕妇等。芽菜拥有密集的细菌种群，通常不会对消费者构成健康风险; 尽管如此，它们是与食源性病原体相关的最常见载体之一。我们的分析证明存在30个属，已知它们含有潜在的和/或概率性的人类病原体。然而，本研究中使用的测序方法不允许在物种水平上鉴定细菌，因此应进行使用宏基因组学和宏转录组学的进一步研究以表征物种水平上的芽菜细菌群落。在储存晚期检测到苜蓿芽菜中的沙门氏菌，表明了与芽菜消费相关的食源性疾病的潜在风险。标准微生物检测未能检测到苜蓿芽中的沙门氏菌可能与病原体的低丰度（每25克<1个细胞）或存在不可培养或死亡的沙门氏菌细胞有关。
虽然本研究中使用的测序方法无法识别亚属水平的分类群，但宏基因组学功能预测分析（PICRUSt）已经确定了与传染病相关的代谢通路，表明一些OTU可能与人类相关（图4）。需要注意的是PICRUSt数据应该谨慎分析，因为预测是基于基因组数据和16SrRNA扩增进行的，而不是经由mRNA直接测定所得。因此，需要使用转录组学的其他研究以验证所鉴定的代谢通路在腐败过程中的作用。
最后，需要进一步研究分析来自其他地方和供应商的苜蓿和绿豆芽的微生物组，以便证实本研究的广适性。
结论
总之，我们的研究首次分析了在冷藏条件下储存期间，与商业芽菜相关的细菌群体随时间的变化。与芽菜有关的细菌群落与植物种类相关，但不依赖于生产环境。在购买时，苜蓿和绿豆芽的优势菌属由假单胞菌和泛菌组成。在苜蓿中，冷藏3周后，假单胞菌的丰度增加，而泛菌丰度下降; 而在绿豆芽中，泛菌在储存2周时成为优势菌属。在160个属中，30个含有已知的致病物种，23个含有腐败相关的物种。
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