科研 | 国人佳作：单细胞RNA-seq分析鉴定半月板祖细胞并揭示半月板变性的进展
编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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哺乳动物半月板是由内侧和外侧两部分组成的新月形组织，在关节稳定性、减震、接触力分布、关节润滑和本体感觉等方面发挥着重要作用。随着年龄的增长，半月板的血管生成减少。半月板在胎儿发育期和出生后不久完全血管化，然而，只有10%-25%的成熟半月板含有血管。根据这些血液供应的差异，半月板可分为外血管区（红区）、内无血管区（白区）和红白区之间的红白区。半月板外侧区含有90%的Ⅰ型胶原，内侧区含有60%的Ⅱ型胶原和40%的Ⅰ型胶原。
半月板的细胞类型是不均匀的，其内部含有软骨细胞样形态细胞，外部含有成纤维细胞样细胞。最近，干/祖细胞被认为存在于半月板中以促进半月板损伤的修复。Gamer等人通过半月板外植体体外培养分离半月板干/祖细胞，这些细胞具有克隆特性，并且大量表达CD44和Sca-1。但是半月板的细胞类型组成和分布，半月板干细胞/祖细胞用于组织工程的生化标记还有待阐明。
半月板退变与膝关节骨性关节炎（OA）之间关系复杂。半月板退行性撕裂与同一节段软骨丢失增加有关，尤其是后角撕裂。Fuller等人发现:在绵羊离体模型中，内外区半月板细胞对炎性细胞因子IL-1α和TNF-α均有反应，导致细胞因子诱导的胶原溶解和聚集溶解。这些研究表明半月板退变在OA发生发展中的重要性,以及它通常能引起关节疾病。退行性半月板含水量增加湿重，胶原和总糖胺多糖（GAG）减少。然而，细胞类型的多样性和相应的生物标记，以及治疗半月板变性的生物靶点，目前还没有完全确定。
单细胞RNA测序技术（scRNA seq）是研究转录的细胞间变异的一种行之有效的方法，它可以用来识别不同的细胞类型，提供生理和病理过程的见解。本研究用scRNA-seq技术对半月板细胞的进行了全面的普查。研究者鉴定了不同的细胞亚群及其基因特征，以确定它们的分化关系和在特定细胞类型中的多样性。研究者还发现半月板干/祖细胞的存在和相应的标记基因。最后，研究者研究了半月板退变对半月板细胞异质性的整体影响，并确定了一个潜在的治疗靶点。
论文ID
原名：Single-cell RNA-seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration
译名：单细胞RNA-seq分析鉴定半月板祖细胞并揭示半月板变性的进展
期刊：Annals of the Rheumatic Diseases
IF：14.3（医学1区）
发表时间：2019年12月23日
通讯作者：廖威明 张志奇
作者单位：中山大学附属第一医院关节外科，中山大学孙逸仙纪念医院骨科
结果
健康人半月板的scRNA-seq普查确定了七个不同的细胞群体
结果显示：用于单细胞测序的细胞质量是符合要求的（原文补充图S1）。为了确定人半月板细胞的组成，研究者使用scRNA技术分析了健康人半月板的半月板细胞（n=3），半月板的无偏聚集发现七个源自健康人半月板的细胞群，包括五个根据经验定义的群体和两个新的群体（图1A）。具体地说，鉴定出以下细胞：（1） 内皮细胞（EC，表达CD93和CDH5），（2） 软骨祖细胞（CPC，表达CDK1和BIRC5），（3） 调节性软骨细胞（RegC，表达BMP2和FOSL1），（4） 纤维软骨细胞（FC，表达COL1A1、COL3A1和COL6A1），（5） 肥大前软骨细胞（PreHTC，表达MMP1和TNFAIP6），（6） 纤维软骨细胞祖细胞（FCP，表达纤维软骨细胞基因COL1A1和COL3A1以及间充质干细胞标记基因MCAM和MYLK），（7）增殖纤维软骨细胞（ProFC，表达纤维软骨细胞基因COL1A1和生长因子FGF7和CTGF）（图1B、C）。其中，FC和RegC含量丰富，而FCP和EC含量相对较少。
Fig1：健康人半月板的单细胞图谱
为了研究不同细胞簇的分布，研究者使用免疫组化检测标志基因表达。MYLK是FCP的标记基因，主要在半月板表面表达，而RegC基因标记BMP2主要在半月板中部表达。CD93是EC的标记基因，主要在红色区域的血管周围表达，而PreHTC标记ZIP8主要在白色区域表达。在红色和白色区域中，ProFC标记COL1A1、FC标记COL3A1和CPC标记CDK1的表达没有发现差异（图1D）。
人半月板祖细胞群体的鉴定
为了研究不同细胞簇之间的关系，研究者用Monocle法重建伪空间轨迹。发现EC和FCP存在于伪空间轨迹的起始处，ProFC位于FC前方，PreHTC位于FC后方。FC和CPC沿轨道分布，RegC主要分布在末端（在线补充图S2A，B）。由于FCP存在于伪空间轨迹的起始处，作者调查了它是否具有祖细胞的特性。通路分析表明，参与局灶性粘附、细胞外基质（ECM）受体相互作用和TGFβ信号传导的通路被激活（图2A）。FCP表达间充质干细胞标记物MCAM（CD146）（图2B），以及肌成纤维细胞的经典标记物，包括ACTA2，MYLK和MYL9（原文补充图S2C）。
Fig2：人半月板祖细胞的鉴定
研究者用荧光激活细胞分选技术（FACS）发现CD146+半月板细胞的比例接近2.7%（图2C）。CD146+细胞能够分化成各种细胞系，包括成骨细胞和脂肪细胞（图2D）。接下来，研究者检测了CD146+细胞的克隆性。总共2000个CD146+和cd146-细胞接种于12孔板中培养7天，培养后发现CD146+组的菌落数明显高于CD146-组细胞的菌落数（图2E）。CD146组细胞能够形成菌落的事实表明另一个细胞簇也可能具有祖细胞特性。CD93是ECs的特异性标记，因此我们使用FACS获得CD146+/CD93+半月板细胞（EC）和CD146+/CD93-半月板细胞（FCP）。进一步的实验表明，这两个细胞簇具有祖细胞特性（原文补充图S2D）。
单细胞轨迹分支点对应于FCP分化
为了研究FCP向子集簇的分化及相应基因的表达，研究者选择了FCP、ProFC、FC、PreHTC和RegC来构建一个新的轨迹，其中包含对应于两个不同细胞命运的两个末端（图3A）。轨迹的起始部位主要是FCP和ProFC，而轨迹的两个末端是由命运1的FC和PreHTC，和命运2的RegC组成（图3B）。接下来，研究者评估了在FCP分化期间调控的基因在轨迹的命运1和2的细胞中的表达情况。结果发现MYLK、CNN1、FGF7和COL1A1的表达相似的。虽然MYLK和CNN1的表达从起始部位到两个命运都明显减少，但FGF7和COL1A1在FCP分化早期表达上调，在分化为两个命运的细胞中表达下调（图3B，C）。ADAMTS4和MMP1在分化早期有轻微上调，在命运1期显著上调，在命运2期显著下调。相反，FOSL1和BMP2在从起始部位到命运1的细胞中表达略有下降，而在通过命运2分化的细胞中表达显著增加。
Fig3：单细胞轨迹分支点分析FCP分化
为了确定单细胞轨迹，作者分析了半月板的体内发育过程，并研究了标记基因在1、2、3、4、8、26、52周小鼠半月板的表达。COL1A1表达在出生后逐渐增加在4周时达到顶峰，然后随着年龄的增加逐渐下降（图3E）。MYLK表达在3周后随着年龄而显著下降（图3E）。这些表达模式与轨迹的两种不同命运一致，表明研究使用的scRNA-seq分析与半月板发育过程相关。
健康人半月板与退化半月板单细胞景观的系统比较
为了综合评估人半月板在退化过程中的变化，研究者首先评估了退化半月板的组织学变化。健康半月板番红O染色阴性，退化半月板染色阳性（在线补充图S3）。此外，退化半月板胶原纤维结构紊乱（图4A和在线补充图S4）。接下来，研究者对健康半月板和退化半月板进行了scRNA-seq比较分析（图4B-E）。结果，研究者检测到退化半月板细胞簇比例的显著变化，包括三个新簇：（1） 单核细胞来源的树突状细胞（MoDC，表达CD14和S100A9），（2） 肥大软骨细胞（HTC，表达CCL20和EREG）以及（3） 退化半月板祖细胞（DegP），在退化半月板中发现并表达骨骼干细胞标记物，如GREM217（图4C-G）。此外，还发现在退化半月板中EC和FCP的表达比例减少（图4E）。
Fig4：健康人半月板与退化半月板单细胞景观的比较
单细胞轨迹的排列表明DegP是半月板变性的关键因素
CDCP1（CD318）在DegP中高表达（原文补充图S4A）。因此，研究者通过FACS分离CD318+原代人退变半月板细胞，以验证其祖细胞能力，发现CD318+细胞形成集落并分化为各种细胞系（原文补充图S4B、C），其中DegP是一个具有祖细胞特性的特殊群体，主要存在于退行性半月板。
Fig5：退化半月板祖细胞(DegP)是半月板变性的关键因素
接下来，研究者选择了4个具有祖细胞特性的簇，包括FCP、ProFC、CPC和DegP，构建新的发展轨迹。轨迹的起始部位主要由FCP和ProFC组成，而树的两个主要终点是由命运1的DegP和CPC，和命运2的CPC组成（图5A，B）。尽管MCAM和MYLK高度表达在轨迹的根部，但它们的表达沿着根部显著减少，一直持续到命运1和命运2（图5C，D）。BIRC5和CDK1在命运2的末端高度表达，而GAS1、RAB3B和CDCP1在命运1的末端高度表达（图5C、D和在线补充图S5A）。然而，在正常的FCP分化过程中，GAS1、RAB3B和CDCP1的表达在从根向命运1和命运2的过程中明显减少（与图3相比），提示命运1可能是半月板退变过程中的一种异常细胞状态。
研究者还通过IHC染色证实了标记基因的表达。MYLK，一个FCP标记基因，在退化的半月板中被下调，而DegP标记基因GAS1和DNER在退化半月板中表达上调，特别是在半月板损伤伴有细胞增殖的区域（图5E）。
促炎症介质，如IL-1β，似乎能直接影响半月板的降解过程。因此，研究者使用IL-1β（5ng/mL）刺激健康人半月板细胞48和96小时，检测CD146+细胞和CD318+细胞的变化。结果发现：随着刺激时间的延长，IL-1β刺激导致CD146+细胞显著减少，而CD318+细胞显著增加（图5F）。此外，研究者还使用IL-1β刺激退化的人半月板细胞，得到类似的结果（在线补充图S5C）。这提示IL-1β等多种致病因子引起的CD146+细胞减少和CD318+细胞增多可能是半月板退变的重要机制。
TGFβ信号通路的激活可减轻退化半月板CD318细胞的增加
以往的研究表明，TGFβ信号的激活增强了半月板前体细胞的分化能力。研究者采用scRNA-seq分析和IHC染色显示TGFβ1，转化生长因子-β（TGF-β）信号通路的一个配体，在健康半月板细胞中高度表达（图6A，B）。研究者还比较了FC-1和FC-2、PreHTC-1和PreHTC-2基因表达的差异，在正常和退化半月板中发现两种细胞类型。与主要存在于退化半月板（FC-2和PreHTC-2）中的细胞簇相比，在健康半月板（FC-1和PreHTC-1）中发现的细胞簇被TGFβ信号途径上调（原文补充图S6），并且高表达COL1A1、COL3A1和TGFβ1（图6C、D）。
Fig6：TGFβ信号通路的激活可减轻退化半月板中CD318细胞的增加
接下来，研究者研究了TGFβ1对DegP的影响。用5ng/mL转化生长因子β1处理人退变半月板细胞48h或96h，流式细胞术显示TGFβ1处理显著减少了CD318+细胞的数量（图6E），qRT-PCR结果显示TGFβ1处理后COL1A1、COL3A1和CDK1的表达明显升高，CD318、S100A9、MMP1和MMP3表达显著降低降低（图6F），提示TGFβ1可能具有延缓半月板退变的作用。
结论
越来越多的研究支持这样的观点：基于细胞的策略可有效改善半月板修复和再生。然而，目前尚不清楚哪种细胞类型对半月板修复最有效。近年来，由于半月板干/祖细胞具有相同的组织来源和组织相容性，被认为是半月板损伤修复最合适的细胞类型，然而，人半月板祖细胞的特性、标记基因和分离方法尚未完全阐明。Gamer等人从培养的小鼠半月板中分离出半月板祖细胞，并进行流式细胞术分析，证明这些细胞高表达CD44和Sca-1。Shen等人利用胶原酶消化人半月板，并以低密度将细胞接种形成菌落。随后的流式细胞术分析显示，这些细胞高表达CD90（THY1）和CD105（ENG），并且关节内注射这些细胞可促进大鼠半月板再生，改善OA。研究者的scRNA-seq分析也显示FCP中的CD90和CD105高表达，然而，它们也在FC-1和FC-2中高度表达。因此，CD90和CD105不是半月板祖细胞的特异性标记。
在研究者的scRNA-seq结果中，EC在一开始就存在在伪空间轨迹上，说明其对半月板的发育、退变和修复起着重要作用。Miller and Rydell于1993年首次分离出半月板EC，证明这些细胞在传代10代后具有自我更新和维持自身特性的能力。EC不仅能产生维持血液供应的血管，而且能促进半月板细胞的迁移。Yuan等人发现，EC可通过激活内皮素信号促进半月板细胞迁移。值得注意的是，研究者鉴定了在EC和FCP中特异表达的CD146，这提示CD146+细胞可以作为半月板损伤修复的细胞支架，同时也可能是半月板祖细胞通过生长因子募集参与半月板损伤修复的无细胞策略的靶点。
研究者发现了三个退化半月板特有的细胞簇，包括MoDC、HTC和DegP，其中DegP是具有祖细胞特性的新型簇。scRNA-seq分析显示，在FCP向DegP分化结束时，DegP标记物GAS1、RAB3B和CD318的表达迅速增加，这与正常的分化过程相反，提示这种分化过程是异常细胞状态的结果。IHC染色也显示GAS1和RAB3B在严重损伤的半月板中高度表达，伴随着细胞增殖。CD318在造血祖细胞和肌肉祖细胞中高度表达。Iwata等人发现，CD318是骨髓成纤维细胞的CD146阴性亚群，调节细胞因子的表达。已有研究表明，IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子可诱导半月板代谢反应，导致半月板退变。本研究采用IL-1β诱导人半月板细胞炎症反应。结果表明，IL-1β可使正常和变性半月板细胞中CD146+细胞减少，CD318+细胞增多。这些结果表明DegP在半月板退变中起重要作用，可作为评价半月板退变的标志物或治疗半月板退变的靶点。
TGFβ 广泛应用于半月板组织工程，由于其通过促进纤维软骨细胞增殖和半月板祖细胞的募集来促进半月板损伤修复和再生。TGFβ还调节半月板的退变过程，而TGFβ信号报告因子ALK5的缺失可加速半月板的退变。本研究的scRNA-seq结果显示TGFβ1是在FC-1和FC-2中高表达的，其整体表达在退化半月板减少。此外，TGFβ1处理已经被证明可提高组织工程化纤维软骨的力学性能。本研究的结果表明：TGFβ1降低了人退变半月板CD318+细胞的比例，这提示TGFβ1可用于抑制半月板退变。
总之，本研究的scRNA-seq分析结果提供了人类半月板细胞成分的一个更清晰一致的图谱，以及特定的细胞簇导致半月板发育和异常变性的方式。本研究证实了半月板祖细胞在半月板组织工程中具有潜在的应用价值，并且还证明了半月板退变的一个重要机制，并为治疗策略提供了实验证据。
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