科研 | 基于转录组和调控网络分析揭示了石斛降血糖作用及其机制（国人二区作品）
编译：贤，编辑：十九、江舜尧。
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2型糖尿病（T2D）是一种长期代谢紊乱疾病，主要表现在高血糖和缺乏胰岛素。前期研究表明石斛属植物降糖效果显著，可以替代药物预防或治疗糖尿病，但其治疗的分子机制仍不清楚。本研究采用生物化学和转录组（RNA-Seq and miRNA-Seq）分析石斛提取物（DFE）对糖尿病和正常组大鼠的肝和胰腺的影响。实验结果表明DFE能通过抑制炎症细胞和阻止胰岛细胞凋亡显著减轻糖尿病症状。在DFE干预下，与miR-148a / 375 / 9a相互结合的Stat /NF-κB/Irf家族中的转录因子是炎症反应和凋亡通路的关键调控因子。与此同时，DFE还能改善肝脏的能量代谢，脂质转运和氧化还原酶活性，进而减少脂质的堆积和脂毒性诱导的肝细胞凋亡。本文研究发现DFE可能可以作为潜在预防2型糖尿病的药物，同时表明转录组分析和基因调控网络分析相结合可以作为研究中药治疗潜在疾病的分子机制的一种有效方法。
论文ID
原名：Systematic transcriptome and regulatory network analyses reveal the hypoglycemic mechanism of Dendrobium fimbriatum
译名：基于转录组和调控网络分析揭示了石斛降血糖作用及其机制
期刊：Molecular Therapy: Nucleic Acid
IF：5.919（二区）
发表时间：2019.10
通讯作者：郭安源&杨祥良&朱艳红
通讯作者单位：华中科技大学生命科学与技术学院
DOI号：10.1016/j.omtn.2019.10.033
实验设计
雄性SD大鼠随机分为三组：正常组、糖尿病模型组和给药组。采用高脂饲料和地塞米松进行造模，石斛水提物（多糖含量56.8%）作为治疗药物（图1A）。造模结束后取肝脏和胰腺组织，并对其进行转录组测序；取血液利用血糖仪测定血糖浓度，利用试剂盒分别检测胰岛素浓度、Il-1β水平、Tnf-α水平、总胆固醇含量、甘油三酸酯含量，抗氧化能力和氧化能力。
图1：正常、糖尿病和DFE给药大鼠（diabetes-DFE）的实验建模过程及DM的特征性体征。（A）研究设计。SD：标准饮食，DEX：地塞米松，HFD：高脂饮食；（B）实验后大鼠空腹血糖（FBG）水平；（C）实验后不同时间点血糖水平；（D）图1C中各大鼠血糖水平AUCs值；（E，F）实验后血清/胰腺胰岛素浓度；（G）血清FFA三组实验后的水平。
结果
1、DFE显著改善高血糖症和改善糖尿病大鼠的葡萄糖耐受量
如图1B-D所示，模型组大鼠的空腹血糖含量远高于正常组和给药组（图1B），进食后60min时，模型组和给药组血糖浓度达到峰值，随后恢复到基础值（图1C），而血糖水平曲线下面积（AUC），模型组的量远高于其他两组（图1D）。血清胰岛素的含量在模型组中最低，给药组恢复部分水平（图1E）。胰腺中的胰岛素含量降低和血清中脂肪酸含量的升高表明模型组造模成功（图1F-G）。
2、转录组分析胰腺和肝脏组织
对三组大鼠的胰腺和肝脏进行转录组分析，在胰腺中获得了12231个基因和276个miRNA，在肝脏中获得14285个基因和177个miRNA；其中miRNA基因中的let-7家族和miR-148/miR-143基因在胰腺中高表达，包含miR-122，let-7a/b/c/f和miR-148等在内的12个miRNA在肝脏中高表达。
3、生物信息学分析DFE对胰腺炎的影响
在胰腺中，模型组VS正常组和给药组VS模型组分别检测到1645个、1704个差异基因，其中588个基因的表达模式相反（图2A），表示这588个差异基因可能是由于DFE降低血糖而导致的。比较有意思的是588个基因中的571个基因在给药组-VS-模型组中下调，而在模型组-VS-正常组中上调，而这571个基因中的74%（422个基因）又与炎症和免疫过程具有强烈相关性（图2B），提示DFE对糖尿病患者的胰腺的作用主要集中在抗炎上。此外在模型组-VS-正常组和给药组-VS-模型组分别还鉴定了70个和59个差异表达miRNAs。
值得注意的，在模型组-VS-正常组中87%显著上调的差异基因富集在炎症和免疫相关过程中，主要包含了“炎症和免疫反应”，“细胞因子和趋化因子通路”，“JAK-STAT/NF-κB//NOD-like/ Toll-like受体信号转导途径”和“凋亡途径”（图2C）。在588个相反表达的基因中，给药组-VS-模型组中显著下调的差异基因主要涉及三个生物学过程：细胞因子受体活性、炎症和免疫过程和细胞凋亡（图2C）。
通路分析表明DFE可能通过抑制白介素和干扰素诱导的炎症/免疫过程来阻止胰岛细胞的凋亡，从而激活下游细胞死亡信号传导，包括JAK-STAT /NF-κB/ TNF途径等（图3A-B）。此外，给药组-VS-模型组中的上调差异基因主要富集在代谢和胰岛素信号通路上。
上述结果表明DFE可能可以减轻糖尿病患者胰腺炎症和免疫反应，抑制胰岛细胞凋亡和增加胰岛素分泌（图1E-F）。与此同时，22个上调和11个下调的差异miRNA具有相反的表达在给药物VS模型组和模型组VS正常组之间（图3C）。
为了研究DFE降血糖的转录调控作用，本文通过在给药物VS模型组和模型组VS正常组相反表达的差异基因和差异miRNAs建立了miRNA-转录因子-基因调控网络，包含21个miRNAs、22个转录因子和124个基因。调控炎症和免疫相关信号通路的miR-148a/375/9a和Stat/Relb/NF-κB/Irf家族中的转录因子作为为枢纽节点，可能有助于研究DFE降血糖作用（图3D）。
结合调控网络分析和差异基因功能富集的结果，推断DFE可能通过抑制重度炎症诱导的胰岛细胞凋亡来缓解高血糖症。
4、转录组分析揭示DFE对肝脏能量代谢和脂质积累的影响
肝脏是胰岛素的主要靶器官，在脂质代谢中起着关键作用，而脂肪肝是糖尿病的主要风险。为了揭示DFE对糖尿病患者肝脏的影响的潜在分子机制，本文研究了肝脏中的转录组。在模型组-VS-正常组中，1222个基因（716个上调和536个下调）和39个miRNA（10个上调和29个下调）的表达水平发生了显着变化。716种上调的差异基因主要富集在“糖异生”和“非酒精性脂肪肝疾病”的生物过程中（图4A），而536种下调的差异基因主要与“脂质代谢”、“谷胱甘肽代谢”和“氧化还原酶活性和肝脏发育”过程（图4A）。同时，在给药组-VS模型组中，有418个差异基因显著上调，而有526个差异基因下调。值得注意的是，DFE可显著恢复糖尿病大鼠中失调的多个过程，例如“糖异生”，“脂质代谢”，“ NAFLD”和氧化还原酶活性相关过程（图4A）。这些结果暗示DFE可以改善氧化还原酶活性和能量代谢，并且可以减少糖尿病患者肝脏中脂质的积累。例如，与胆固醇和脂蛋白转运相关的基因（例如Apoa1-2/Apoc1-3/Lcn2/Rbp4）的表达水平在模型组和给药组之间显示出相反的表达（图4B）。同时，某些miRNA的表达谱随着DFE给药用而发生了显着变化，例如miR-375/miR-9a/miR-143/miR-127和miR-486/miR-451（图4C）。
为了研究DFE给药时差异基因和差异miRNAs如何减少脂质，本文利用在给药组-VS-模型组中具有相反表达的差异基因和差异miRNAs构建了miRNA-转录因子-基因调控网络（219个结点和1240个边）。miR375/9a/143/127/192与它们的靶标之间的调节相作是调控网络中的核心模块，表明它们在DFE减轻糖尿病患者的肝脏中的关键作用（图4D）。
5、实验验证DFE可通过抑制炎症诱导的胰岛细胞凋亡来缓解高血糖症
为了验证转录组分析预测DFE对糖尿病胰腺的抗炎和抗凋亡作用，进行了细胞和分子生物学实验（图5）。与模型组相比，DFE给药后血清和胰腺中的炎症标志物（如细胞因子Il-1β和Tnf-α）水平显着降低（图5A），表明DFE可以减轻糖尿病患者胰腺炎反应。本文还检查了三个实验组的胰岛细胞的细胞结构和凋亡情况。正常组和给药组的胰岛组织切片显示情况良好，而在模型组中胰岛细胞被大量破坏（图5B）。同时，TUNEL分析表明，给药组显著降低了胰岛细胞凋亡率（正常组：10％，模型组：82％，给药组：39％，图5C）。与炎症诱导的胞细凋亡相关的标志物基因（如Casp3/Bcl2/Bax/Inf-γ/Tnf-α/Il-1β/Stat1/Il-17r）的表达水平，证明DFE可以减轻大鼠体内胰腺的重度炎症和细胞凋亡（图5D）。此外，与模型组相比，给药组中胰岛素基因的表达水平显着上调（图5E），表明DFE可以抑制胰岛细胞凋亡，从而增加胰岛素水平，有助于预防和治疗糖尿病。
5、实验验证DFE可减轻糖尿病肝脏代谢紊乱和细胞凋亡
转录组分析结果表明，DFE可以减少糖异生，增加氧化还原酶活性和脂质转运，部分减弱NAFLD并促进肝细胞再生（图6）。为了验证DFE对糖尿病肝脏的影响，检测了与能量和脂质代谢有关的一些指标的水平，例如肝脏中的总胆固醇/甘油三酸酯/抗氧化能力/氧化能力，糖原积累和肝细胞凋亡率（图6）。结合之前的研究，HFD＆DEX可以改变肝脏中的葡萄糖和脂质代谢，进而导致脂质蓄积和脂毒性诱导的细胞凋亡（图6）。本文的结果表明，与模型组相比，给药组显著降低了总胆固醇/甘油三酸酯/氧化能力，而增加了总抗氧化能力和糖原存储量（图6A-E）。同时，在模型组中，肝细胞的形态和结构随着严重的脂质增加而发生明显变化，而给药组显著降低了脂质的积累（图6F）。此外，TUNEL实验表明，与模型组相比，给药组的肝细胞凋亡得到了显着抑制（凋亡率：模型组约为72.9％，给药组约为28.3％，图6G，H）。
结论
糖尿病是一种代谢紊乱疾病，通常源于胰腺β细胞功能异常，可能损害胰岛素靶器官如肝脏等。在这项研究中，评估了DFE的抗糖尿病作用，并探讨了DEF对胰腺和肝的潜在作用机制。结果表明：1）DFE可以减轻胰腺炎反应，并预防胰岛细胞凋亡，这可能有助于保护或恢复β细胞的功能量。2）DFE可以改善能量代谢，增强肝脏中的氧化还原酶活性和脂质转运，从而减少脂质积累和脂毒性诱导的肝细胞凋亡。
β细胞占胰岛胰岛细胞的65-80％，在发炎的情况下容易受伤。糖尿病大鼠中的低胰岛素和高葡萄糖水平（图1E，1F）可能是由β细胞凋亡（图5C）引起的。数据表明，DFE给药可通过抗胰腺炎作用，和阻止β细胞凋亡来缓解高血糖症（图5和7A）。与模型组相比，DFE给药显著下调了一些关键基因（例如Il-1β，Il-17r，Inf-γ，Tnf-a，Stat和NF-κB等）的表达水平，表明给予DFE可能会抑制胰岛中Tnf-a和Fas / FasL依赖的凋亡途径（图5）。此外，DFE给药显著提高了胰岛素信号传导和代谢途径中基因的表达水平，包括“支链氨基酸（BCAAs）降解”，“脂肪酸降解”和“PPAR信号传导”途径。“PPAR信号传导”和“脂肪酸降解”途径的激活可以通过上调脂肪酸氧化来减少β细胞凋亡，而增加的BCAAs水平可以作为胰岛素作用受损的生物标志物。
在给药组-VS-模型组比较中，作为促凋亡剂的miR-21/222/146被显著下调。miR-148a/375/9a与转录因子Stat/Relb/NF-κBs/Irfs结合作为调节炎症和免疫相关信号通路的核心模块，可能有助于减轻给药组的高血糖症（图3D）。miR-375和miR-148在维持胰腺细胞，胰岛素生物合成和正常葡萄糖稳态方面起着重要作用，与模型组相比，其在DFE给药后胰腺中高表达（图3C）。同时，转录因子Stat/Relb/NF-κBs/Irfs可以促进细胞凋亡，DFE的给药导致它们的表达显著下调（图3C，图5D）。
综上所述，推断DFE在糖尿病胰腺中起着抗发炎和抗凋亡的作用（图7A），可以防止β细胞的损伤并恢复胰岛素的分泌（图5）。肝脏作为胰岛素的主要目标组织，可以维持代谢过程的稳态。
肝细胞中的脂质蓄积在糖尿病中非常普遍，并可能通过脂质代谢和运输紊乱而增加糖尿病风险，这可能将胰岛素功能障碍与肝脏代谢紊乱联系起来。过多的脂质蓄积可能导致NAFLD（图4A），并进一步使肝细胞凋亡并降低细胞再生。实验结果表明，DFE可以：1）增强糖尿病肝脏中的氧化还原酶活性，脂质转运和器官再生（图4A，图6）；2）显着降低肝细胞中的糖原消耗，脂质积累和细胞凋亡（图6）。
关于脂质转运的基因（Apo家族，Lcn2和Rbp4等）在给药组-VS-模型组和模型组-VS-正常组之间显示相反的表达趋势（图4B），表明它们给药后，在减少脂质浸润中起关键作用。而且，涉及脂质代谢和细胞死亡的核心模块miR-9/375/127/143/192和Srebf1 / Klfs（图4D）可能在DFE对肝脏的作用中起重要作用。例如，过表达的miR-9可以降低肝脏中的细胞内脂质含量，而上调miR-375的表达可以抑制HCC细胞中的线粒体自噬，这可能有助于DFE对我们肝细胞的抗凋亡作用研究（图6G，6H）。此外，miR-192-Srebf1-Cyp7a1-Atp5g1调节在脂质代谢/体内平衡中起关键作用。靶向Klf9/Klf13的miR-192/127/143调节其下游基因，在此充当了我们肝脏调节网络的关键模块（图4D）。这些模块与肝脂肪变性和脂质蓄积有关，并可能抑制NAFLD的发生和发展。例如，Slc35c2作为参与细胞死亡过程的Slc35家族成员可以增强活性氧，这在网络调控中由mir-143和Klf13共同调节（图4D），其下调可能有助于增加抗氧化能力（图6C，D）。
结合这些发现，DFE对糖尿病肝脏最显著的作用可能集中在维持能量和脂质代谢之间的平衡，然后改善糖异生和脂质蓄积失调引起的副作用（NAFLD和肝细胞凋亡等）（图7B）。
由于RNA的质量，测序样本的数量在不同的组或组织中是不同的。为了避免这种局限性，研究者通过生理和分子实验验证了转录组谱分析的主要结果。转录组分析与实验结果之间的高度一致性和正相关性表明，作者从测序数据中得到的分析结果反映了实际情况。另一个限制是由于中药中复杂的化合物以及这些物质之间可能的相互作用，通常难以确定中药的详细生物活性成分，而且尚未研究每种化合物对糖尿病的贡献。总之，本研究发现确立了DFE在调节β细胞凋亡和能量代谢中的作用，表明DFE对高血糖和糖尿病具有潜在的治疗意义。此外，转录组分析提供了一种有效的方法，以阐明受中药干预影响的调节途径和机制。转录组分析和调控网络分析的结合可以为基因表达的变化和潜在机制提供全面的帮助，这也可以提供新的见解，以探索潜在的中药对疾病影响的调控机制。