科研 | Semin. Cancer Biol.：肉瘤的蛋白组学研究-现状和机遇(下)
编译：伊安，编辑：小白、江舜尧。
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肉瘤是一组具有70多个组织学亚型的间充质恶性肿瘤。目前大多数肉瘤发生发展的分子机制尚未明确，这阻碍了肉瘤的临床治疗和预后发展。迄今为止，蛋白组学技术已广泛应用到了肉瘤研究领域。目前蛋白组学研究的重点主要集中在组织学亚型上，这包括对肉瘤的生物学特性的研究，以及鉴定出用于临床诊断、预测和预后的候选标志物等，该领域还处于起步阶段，其蛋白组学研究结果尚未转化为临床应用。在这篇评论中作者对几种罕见和超罕见肉瘤组织学亚型的蛋白组学研究进行详细地阐述，这些亚型包括胃肠道间质瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性横纹肌瘤、尤文肉瘤、粘液性纤维肉瘤和肺泡软组织肉瘤。同时，将蛋白组学与其它分子数据结合，探讨蛋白组学在临床实验中的应用，以期促进对这类复杂罕见癌症的生物学特性的了解和临床研究。
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内容
3. 肉瘤中蛋白组学研究的现状
骨肉瘤是由来源于成骨的间充质干细胞恶性转化所引起的，它是最常见的原发性恶性骨肿瘤。骨肉瘤发病率约为百万分之4.2，无性别差异，呈双峰状年龄分布，第一个发病高峰在24岁之前，第二个在60岁以后。组织学上，骨肉瘤细胞形状不一，核大，深染。骨肉瘤细胞参与产生细胞外基质，肿瘤细胞产生类骨质是诊断的先决条件。骨肉瘤组织学变异的详细内容超出了本综述的范围，但已在其他地方详细介绍。生物分子学研究显示骨肉瘤具有染色体不稳定性、高水平的结构变异和基因拷贝数变异。
此外，小儿骨肉瘤单核苷酸变异表现出kataegis（一种局部高突变模式），即在肿瘤蛋白p53（TP53）、视网膜母细胞瘤蛋白1(RB1)、地中海贫血伴精神发育迟滞综合征基因(ATRX)、突触后密度蛋白93（DLG2）基因经常出现反复突变。化疗药物的增加提高了骨肉瘤的存活率（OS），从5年OS率从20世纪50年代的19.3%提高到80年代的60%左右。在过去的三十年，由于手术、植入物设计的改善和疾病意识的提高，肢体保留率与截肢率相比有所提高，但5年的OS率一直处于平稳状态。然而，在过去的三十年，由于手术技术、植入物设计和疾病意识的提高使得肢体的保留率有所提高，但5年的OS率一直处于平稳状态。
骨肉瘤治疗包括化疗等。但是，患者对治疗的反应差异较大，目前还没有预测患者反应的方法。目前已有两项研究通过使用蛋白组学研究评估了化疗的治疗效果，这解决了生物标志物缺乏的问题。Kikuta等人使用2D-DIGE筛选异福酰胺（IFO）、阿霉素和顺铂（CDDP）这三种化疗药物的生物标志物，分别对化疗反应不佳患者（<90％坏死组织和效果良好患者（>90％坏死组织）的6份肿瘤活检样本进行了分析，鉴定出包括过氧化物酶2（PRDX2）的38种差异表达的蛋白， PRDX2在化疗反应不佳中高度表达。随后在另外4例骨肉瘤患者的独立队列中通过Western blot证实了PRDX2蛋白表达与患者反应不佳的相关性。在另一项研究中，Kubota等人对反应不佳和反应良好的患者进行比较，来预测患者对甲氨蝶呤（MTX）、阿霉素、COPD的化疗反应，使用2D-DIGE对来自6个反应不良和7个反应良好患者的预处理组织进行蛋白组学研究，作者发现两组间显著差异表达的蛋白有27个。与Kikuta等人研究一致，同样发现PRDX2在反应不佳的患者中被上调。为了进一步研究PRDX2表达与细胞对MTX、阿霉素、CDDP应答之间的关系，通过使用MNNG/HOS、MG63、143B骨肉瘤细胞系进行了细胞活力检测，结果显示当PRDX2被RNAi沉默后，所有细胞系的细胞活力都明显下降。此外，敲除PRDX2后细胞增殖、侵袭、迁移减少。综上所述，这两项研究表明，PRDX2的表达可作为患者化疗分层的候选生物标志物，并可能是骨肉瘤等侵袭性疾病的驱动因子。
除了对骨肉瘤进行蛋白组学研究以寻找生物标志物外，全球蛋白组图谱已被用于更好地了解骨肉瘤的致癌机制以及揭示新的治疗靶点。Chaiyawat等人通过2D-DIGE对4名化疗肿瘤患者的组织进行蛋白组学分析，结果表明29种蛋白显著上调，这些蛋白主要富集在代谢、生物调节和蛋白结合活性等方面。本体网络整合表明未折叠蛋白反应(UPR)成分增加，包括78kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78)、内质网素(GRP94)、钙网蛋白(ERP60)和核纤层蛋白A/C。在6个原代骨肉瘤细胞系中用Western blot对这些候选蛋白进行了验证。蛋白组学数据结果表明，与原代成骨细胞相比，骨肉瘤细胞中GRP78、GRP94和核纤层蛋白A/C的表达上调。此外，我们通过western blot对9例骨肉瘤患者的肿瘤组织进行了UPR蛋白表达研究，并将其与疾病分期进行结合。9例患者中，3例为IIB期，化疗反应良好(肿瘤坏死>90%)，3例为IIB期，化疗反应不佳(肿瘤坏死<90%)，3例为III期(转移型)。结合临床分期，GRP94在骨肉瘤中表达上调，ERP60在Ⅱ期中表达上调，同时与反应良好的患者相比，在反应不佳患者中GRP78呈上升趋势。
综上所述，这些研究结果表明，针对UPR途径的靶向治疗可能是一种具有可行性的治疗方法，并且能够针对UPR，这可能有助于治疗对常规化疗反应不佳的患者。
尽管临床治疗原发性骨肉瘤疗效显著，但许多患者随后发展为转移性病变，最常见的是肺转移。肺转移的存在加剧了疾病的恶化，同时这也是导致骨肉瘤患者死亡最常见的原因。然而，骨肉瘤发生的确切分子机制尚未明确。为了识别可能对肿瘤转移具有驱动作用的蛋白，科研工作者通过2D-DIGE对胎儿成骨细胞系CRL11372，骨肉瘤细胞系CRL7023、CRL7134、CRL7140以及骨肉瘤肺转移细胞系CRL7585、CRL7631、CRL7645进行蛋白组研究。与成骨细胞相比，骨肉瘤和转移性骨肉瘤细胞中有13个蛋白表达上调，4个蛋白表达下调。13个上调蛋白组成的单一网络中V-myc骨髓细胞瘤病病毒癌基因同源物(MYC)、微管不稳定蛋白1(STMN1)、组织蛋白酶D(CTSD)和TP53为枢纽节点。对STMN1和CTSD进一步验证，CTSD的蛋白免疫印迹与蛋白组学的结果一致，表明原发性骨肉瘤和转移性骨肉瘤中CTSD表达增加。然而，骨肉瘤细胞中STMN1表达减少未能在蛋白免疫印迹中得到验证。IHC进一步验证了CTSD在肿瘤芯片(TMA)中的表达，TMA包括4个正常骨组织、17个原发性骨肉瘤和5个肺转移骨肉瘤样本。通过IHC评分，证明CTSD在骨肉瘤中的表达高于正常骨组织，而且在肺转移灶中的表达明显高于原发性骨肉瘤。三个实验结果均显示CTSD的表达存在差异，因此将CTSD假设为骨肉瘤发生和转移的驱动蛋白。除了作为转移性病变的标志物，CTSD靶向治疗可能是治疗骨肉瘤的新方法，这可能有利于对转移性疾病进行治疗。
ES是第二种最常见的原发性恶性骨肉瘤，儿童和年轻人多发， 15岁时发病率最高。ES具有侵袭性，同时有局部复发和早期血行转移的倾向，最常见的肺转移。组织学上，ES由片状的小圆形细胞组成，核浆比高，很少有有丝分裂活性，通常包含高碘酸希夫氏阳性颗粒。ES是一种易位驱动肿瘤，t(11；22)(q24；q12) 易位，导致EWSR1-ERG基因融合,出现85%的病例；t(21;22)(q22;q12)易位,导致EWSR1-ERG基因融合,出现5%的病例；和其余5%的病例是由其他易位所导致的，所有这些易位都导致了包含部分EWSR1基因的融合。这些易位产生的融合蛋白由于保留了EWSR1的N端转录激活域而被作为异常转录因子。ES的发生是由下游靶基因的上调所驱动的，下游靶基因包括核受体亚家族0B组成员1(NR0B1)，GLI家族锌指蛋白1(GLI1)和转录因子的叉头盒(Fox)组通过下游靶基因的上调来驱动ES肿瘤的发生，这些下游靶基因包括核受体亚家族0 B组成员1（NR0B1），GLI家族锌指1（GLI1）和叉头框蛋白（FOX）的转录因子。ES对放射和化学均敏感，其临床管理依赖于多模式治疗。当前的治疗包括诱导化学疗法，手术切除以及术后化疗是否合并放疗。在切除标本中观察到的肿瘤坏死程度，作为对诱导化疗的反应，与改善OS相关，尽管这仍是一个有争议的问题，而与单独手术相比，术后放疗已经能够显著改善局部复发。肿瘤坏死程度能够反映化疗的临床疗效，尽管仍存在争议，但它与改善OS有关。虽然与单纯手术相比，术后放疗显示局部复发率显著降低。
EWS-FLI1融合是ES发生的关键。因此，EWS-FLI1的下游效应因子和靶蛋白可能参与了疾病的发病机制。为了鉴定这些候选蛋白，使用2D-DIGE对ES细胞系TC-71和EWS-FLI1敲除TC-71细胞系变体shEWS-FLI1进行了比较蛋白组学分析。研究结果显示25个蛋白在SHEWS-FLI1细胞中差异表达，其中14种蛋白表达下调。差异表达蛋白基因本体论显示，shEWS-FLI1细胞的差异蛋白富集在DNA和RNA加工，这与EWS-FLI1的转录作用一致。有趣的是，网络分析显示TNF受体相关因子6（TRAF6）是一种可激活NF-κB和JUN泛素化连接酶，同时它也是是EWS-FLI1上调的中枢节点。在42个ES样本的独立队列中通过IHC进一步评估了TRAF6的表达水平，结果表明ES肿瘤细胞内不存在TRAF6，并提供了肿瘤中TRAF6的空间分辨率。该分析表明TRAF6主要分布在炎症细胞周围，这暗示炎症在ES的癌发生中起着潜在的作用。
除了对肿瘤细胞进行蛋白组学研究，其他研究还表明ES细胞也具有独特的分泌蛋白。在Hawkins等人的研究中发现，在无血清培养基中分离了2种ES细胞系TC32和CHLA10，并使用MS蛋白组学进行研究。本研究共从TC32细胞中获得2336个蛋白，从CHLA10细胞中获得857个蛋白。鉴定出的蛋白被映射到人类蛋白图谱，那些标注为“分泌”的蛋白(543个来自TC32细胞，259个来自CHLA10细胞)被归类为肿瘤分泌蛋白。综合这些数据发现，在CHLA10分泌物中也能检测到TSC32分泌蛋白的33％以上，同时考虑到已有报道表明ES中存在胰岛素样生长因子（IGF）信号的异常，这暗示不论何种细胞系都存在ES共有分泌蛋白。
以前的报道显示ES中存在癌症干细胞(CSC)，可以通过细胞表面富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)的表达对其进行鉴定LGR5是Wnt3a和R-Respondin-1的靶标，一旦与Wnt受体结合，就会与其他Wnt受体相互作用，触发它们的内化和降解，从而增强Wnt/β-catenin信号转导。向ES细胞中添加Wnt3a配体能够模拟在CSC中观察到的高Wnt/β-catenin信号传导。Hawkins等人试图研究补充Wnt3a对ES的影响。本研究分别将Wnt3a添加到TCS32和CHLA10中，分别鉴定出33个和16个差异表达蛋白。基因富集分析显示，Wnt配体分泌蛋白富集了调控细胞外基质(ECM)组织和ECM-细胞相互作用的蛋白，其中包括几种在胶原蛋白和细胞外基质中具有已知作用的蛋白，例如转化生长因子Beta诱导（TGFBI），母系蛋白3（MATN3），解整合素金属蛋白酶9(ADAM9），基质金属蛋白酶19（MMP19），和细胞粘合素C（TNC）。
胃肠道间质瘤（GISTs）是最常见的一种胃肠道软组织肿瘤，从食道到直肠等部位均有可能发病，胃间质瘤最常见(60%的GIST)，其次是小肠间质瘤(25%)，发病年龄高峰在70岁左右，多见于男性。胃肠道间质瘤细胞是由细长的梭形细胞增殖分化为为多核上皮样细胞，形态具有多样性。目前已确定75%的GISTs在原癌基因KIT中存在功能突变。KIT是III型受体酪氨酸激酶家族的成员，突变的基因导致配体激活和下游细胞内信号通路的传导。已有研究证实KIT突变对GISTs预后具有指导意义，与外显子11突变相比，外显子9突变病情更加有严重，而外显子11缺失具有更高的复发率。除KIT突变外，另有10%的GISTs存在血小板衍生生长因子受体α(PDGFRA)基因突变。PDGFRA也是III型受体酪氨酸激酶家族的成员，突变再次导致受体被激活，触发下游的细胞内信号通路传导。研究结果表明15%的GISTs患者不存在KIT或PDGFRA突变。GISTs细胞具有异质性，存在多种基因突变，包括B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BRAF)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和神经纤维素1(NF1)，同时已有研究表明这些基因在GISTs中被磷酸化。因基因突变对GISTs具有促进作用，所以通过对GISTs患者服用酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(IM)的疗效进行研究来验证酪氨酸激酶抑制剂对GISTs的治疗效果。由于IM抑制断裂点聚集区-Abelson小鼠白血病癌基因（BCR-ABL）融合蛋白，最初用于治疗慢性髓系白血病。同时由于ABL和KIT结构的相似性，科研工作者在临床实验中证实了IM在GISTs中的疗效。IM因此改变了晚期GISTs的治疗现状，与常规化疗相比，经IM治疗的OS超过了60%。在这一部分，我们将通过蛋白组学对使用IM和其他酪氨酸激酶抑制剂产生不同反应的患者进行研究，同时探索原发性和获得性耐药的机制。
GIST病变位置对临床病程具有指示作用。通过对不同部位GIST组织进行蛋白组学分析能够为特定解剖位置的分子图谱提供参考，从而提高对疾病发病机制的理解。对4例手术切除胃的GIST(其中2例为KIT/PDGFRA野生型，2例存在KIT突变)和4例手术切除小肠的GIST(55例)患者病变组织进行了ESI-MS/MS比较蛋白组学分析，结果显示在这两个解剖位置54种蛋白表达差异。其中，29个蛋白在肠道GIST中上调，25个蛋白在胃GIST中上调。另一研究对GIST患者病变组织进行转录组学分析，并将结果与蛋白组学结合，发现18个蛋白与基因表达水平一致。值得注意的是，肿瘤抑制蛋白，早幼粒细胞白血病蛋白（PML）在肠道GIST中的表达下调。通过免疫组化(IHC)对156例GIST(肠道GIST15例，胃GIST128例，其它GIST13例)的独立队列进行研究，所有肠道GISTs均为PML阴性。随后将IHC结果与临床数据结合，发现PML阳性病例的5年无复发生存率(91.7%；胃和其他GIST病例)高于PML阴性病例(60.1%；肠道和其他GIST病例)。
识别预测GIST高复发风险的生物标志物将改善疾病监测和临床管理。为了发现能够预测GIST复发的生物标志物，Suehara等人使用2D-DIGE对8例术后1年内清除转移病灶的患者(P-GIST)和9例术后2年无肿瘤转移的患者(G-GIST)进行研究，这些病例中的1例P-GIST和3例G-GIST均为KIT野生型，其余均有为KIT突变，研究表明P-GIST和G-GIST之间有25个蛋白表达差异。值得注意的是，研究人员发现胃间质瘤组织中钾通道四聚化结构域-12（(pfetin)）蛋白在G-GIST中明显高表达。为了验证最初的蛋白组学结果，对210个GIST样本进行了IHC分析。在这个队列中，pfetin的阳性表达与临床预后差相关，如肿瘤大小、有丝分裂指数和分化程度增加。Pfetin表达与风险分类有关，但这种显著性差异仅限于低风险(G-GIST)病例。已有报道表明91%的低危病例呈pfetin阴性，然而只有50%的高危病例呈pfetin阳性。因此，作为疾病复发的预测因子，pfetin表达只能用于识别低风险患者。几项独立的研究也证实了pfetin表达与GIST预后良好相关。
此外，Kikuta等人对8例P-GIST和9例G-GIST进行了研究。和以前一样，发现P-GIST和G-GIST之间存在25个差异表达蛋白。从中选出DDX39进行进一步验证，DDX39是一种ATP依赖的RNA解旋酶，在P-GIST中上调。通过IHC分析对72个GIST样本进行研究证实DDX39与预后的初步关联。在IHC分析研究中，GIST样本表现为高表达或低表达DDX39。与DDX39低表达的患者相比，DDX39高表达患者具有更短的生存概率，这表明DDX39高表达是GIST转移的预测因子，同时预示患者预后不良。尽管研究强调DDX39和pfetin表达都可以预测GIST的复发，但它们在临床上的有效性还未确定，还需要进行进一步研究，但这些研究表明，蛋白组学可以识别用于风险分层的生物标记物，从而识别可能从辅助治疗中获益的高危患者。
除了DDX39和pfetin被确定为GIST中疾病复发的候选驱动因子外，蛋白磷酸酶也被认为是肿瘤复发的关键调节因子。最近，我们对13个与正常组织相匹配的GIST样本进行了全面的定量蛋白组学研究。研究包括各种复发风险亚型样本；根据美国国立卫生研究院的共识标准确定为3个低度复发风险，5个中度复发风险和5个复发风险患者，这项研究发现，与正常组织相比，剪接体通路富集的蛋白在肿瘤样本中表达上调，相反，代谢通路中富集的蛋白下调。此外，不同风险亚型的比较显示131个蛋白差异表达，其中高表达蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTPN1）与较低风险相关。通过IHC分析对这131个GIST患者样本机芯研究证实这一结果。结合临床数据结合发现高PTPN1与高生存率相关。
尽管IM的介入改善了GIST病情，但大部分患者在2年内会出现耐药性，这主要是由于KIT和PDGFRA二次基因突变。大量研究中使用蛋白组学对IM治疗GIST的作用机制进行研究，并进一步解释了GIST对IM产生耐药性的原因。DaRiva等对GIST组织标本进行了蛋白组学分析，以确定其对IM的反应机制。使用MALDI-MS对1例未经治疗的GIST病例（存在KIT突变），7例对IM治疗反应良好的病例（均具有KIT突变）和8例无反应的病例（1例KIT野生型，5例具有KIT突变和2例PDGFRA突变）进行蛋白组学分析，结果显示IM敏感的病例中干细胞生长因子（SCGF）的表达上调。IHC分析显示，SCGF的高表达仅限于基质，这与先前观察到的基质间质中树突状细胞分泌SCGF一致。综上所述，这些研究结果表明免疫微环境可能是GIST中IM反应的关键介质。
MS研究了IM对c-KIT抑制反应中细胞激酶的调节。Takahashi等人使用iTRAQ标记和磷酸酪氨酸肽的免疫富集对IM敏感细胞系GIST-T1进行研究，应用磷酸化蛋白组学评估IM治疗后蛋白酪氨酸磷酸化水平。作者发现在IM处理72小时后，11种蛋白酪氨酸磷酸化水平增强。粘着斑激酶(FAK)和FYN用来评估细胞对IM敏感性，通过RNA干扰(RNAi)抑制FAK和FYN的表达后，GIST-T1细胞对IM表现出更高的药物敏感性。为了进一步研究这些蛋白对耐药的影响，从长期培养GIST-T1细胞中产生的耐药克隆中分离出GIST-T1 IM耐药细胞。在这些GIST-T1 IM耐药细胞中使用选择性抑制剂TAG372抑制FAK磷酸化会引发细胞凋亡。Takahashi等人的研究强调利用药物抑制FAK和FYN活性可能是有利于克服GIST中IM耐药情况。Nagata等使用MS对IM敏感和KIT激活的GIST882细胞进行了全面的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化蛋白组学研究。为了比较IM耐药和敏感细胞蛋白表达差异，长期采用剂量递增的方式对IM耐药GIST882变异细胞(GIST882-R)进行干预。对有无IM干预的细胞进行磷酸化蛋白组学分析，结果表明在IM耐药细胞中，KIT和另一种酪氨酸激酶-表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化显著上调。此外，两个激酶下游的信号分子，如磷酸化ERK1/2和JNK2上调，表明KIT和EGFR信号轴传导增强。用EGFR抑制剂吉非替尼处理GIST882耐药细胞，细胞对IM敏感性增加，表明EGFR信号通路激活在IM耐药的发生和维持中起重要作用。
除了分析GIST882细胞的磷酸化蛋白组学，Berglund等人还在另一项研究中对其分泌蛋白进行了研究。在血清饥饿条件下对这些细胞上清进行LC-MS/MS分析，共鉴定出375个蛋白，在完全培养基条件下时鉴定出555个蛋白。为了探讨KIT激酶活性对GIST882细胞分泌体的影响，用IM干预GIST882细胞。收集有无IM干预GIST882细胞的细胞上清进行蛋白组学分析，IM干预的细胞中差异表达蛋白富集在蛋白翻译和转录调控以及调节外泌体释放等生物过程。此外，对外泌体数据库的查询显示，IM干预的细胞中绝大多数蛋白属于外泌体蛋白。
随后，Atay 等通过LC-MS/MS对GIST882细胞和GIST-T1细胞进行外泌体蛋白研究，发现外泌体中含有丰富的KIT蛋白和IM反应蛋白，如侧支发芽因子同源物4(SPRY4)和Exfeit 4(SURF4)。同时对KIT、缺氧诱导因子-1(HIF-1a)和信号转导子和转录活化子1(STAT1)蛋白表达进行体内验证。从血浆样本中分离的患者来源的GDEs的免疫印迹证实， KIT、HIF-1α和STAT1蛋白在患者外周血中高度表达，这一结果与体外实验一致。这些研究表明，通过液体活检检测外周血中外泌体蛋白表达可以快速评估GIST患者接受IM治疗后的临床疗效及复发情况。
综上所述，这些结果表明蛋白组学在GIST中具有重要的应用价值，有助于发现能够预测或评估临床疗效、临床预后和复发的新的生物标记物，同时能够为深入了解IM敏感和耐药的发病机制提供依据。
脂肪肉瘤（LPS）是一种常见的成人STS亚型，约占所有肿瘤的20%。LPS主要是由于脂肪细胞发生基因突变所引起的，同时可根据其组织学和生物学特征将其分为不同的亚型。最常见的LPS亚型包括高分化型(WDLPS)和去分化型脂肪肉瘤(DDLPS)，而较少见的是黏液样脂肪肉瘤(MLP)和多形性脂肪肉瘤(PLPS)。WDLPS和DDLPS倾向于发生在腹膜后，症状延迟出现后导致患者确诊时肿瘤体积已变大。组织学上，WDLPS与成熟脂肪组织相似，有纤维间隔和细胞核异型性，而DDLPS更类似于未分化或梭形细胞肉瘤。DDLPS通常被认为是WDLPS附近的非脂肪细胞肉瘤，这表明WDLPS有向DDLPS转化的倾向。临床上，WDLPS具有局部侵袭特性，无转移倾向，而DDLPS更具有侵袭性，容易发生局部复发和远处转移。尽管临床表现不同，WDLPS和DDLPS都有相似的遗传畸变，表现为一个12q21-15扩增子产生了12号环状染色体，其中包括MDM2原癌基因(MDM2)和细胞周期依赖性激酶4(CDK4)。通过对WD-和DDLPS组织进行分析，DDLPS样本含有上述提到的较高数量的12号染色体扩增片段、细胞拷贝数变异和融合转录本。
MLPS倾向于出现在四肢的深部软组织，发病高峰在40-50岁。组织学结果显示MLPSMLPS显示黏液样基质中含有椭圆形和环形细胞，环形细胞的比例越高，临床预后越差。与WD/DDLPS不同，MLP是一种易位驱动型肉瘤，其特征是多见t(12，16)(q13；p11) 易位以及t(12，22)(q13；q12) 易位少见，分别将RNA结合蛋白(FUS)或EWS结合蛋白-1(EWSR1)与12号染色体上的DNA损伤诱导转录因子-3(DDIT3)进行融合，这些新的转录因子能够抑制脂肪细胞分化。PLPS是最不常见的LPS亚型，但其侵袭性最强，约有40%的PLPS患者发生肿瘤局部复发或远端转移。PLPS通常发生在50岁以上老年人，其组织学特征是包含数量不等的多形性脂肪母细胞。由于PLPS的罕见性，因此对其亚型研究相对缺乏，然而，已有报道表明：尽管已知肿瘤抑制因子RB1在内的13q14.2-q14.3缺失在60%的PLPS中被观察到，但这种复杂核型存在不可预测的增加和缺失。
癌症的早期发现会导致大量未证实的临床结果。提高疾病早期诊断率的一种方法是通过常规采血检测外周血中肿瘤生物标志物，血小板是肿瘤微环境的基本组成部分,并被认为是肿瘤生物学的一个重要方面。特别是血小板可以特异性减少LPS中显著上调的血管紧张素。Cervi等人通过对MLPS异种移植小鼠模型中的血小板和血浆蛋白进行表面增强激光解吸/电离质谱分析，值得注意的是，血管内皮抑制素4 (PF4)，在肿瘤移植120天后的LPS移植瘤小鼠血小板中显著表达。在第120天观察到PF4水平持续升高，而在第19天PF4水平也显著升高，但移植瘤小鼠只生成了显微镜下观察不到的、无血管生成的肿瘤。本研究强调PF4是一种很有前途的肿瘤早期诊断生物标志物，可用于诊断目前成像方式无法检测到的肿瘤患者。
蛋白组学研究表明通过LPS生物标记物能够预测高度分化的脂肪肉瘤去分化。非典型肉芽肿块(ALT)是一种分化良好的良性肿瘤，可去分化并发展为侵袭性恶性肿瘤。目前，解剖部位是唯一已知的能够预测去分化的因素。识别这样的生物标记物可以使那些有去分化风险的患者分层，并顺次突出最有可能从更频繁的辅助治疗监测或潜在实验中受益的患者亚群。考虑到这一点，McClain等人通过IHC和2D-DIGE比较ALT和DDLPS来鉴定可预测去分化的生物标志物。DDLPS中的WDLPS与ALT相比有包括硒结合蛋白1(SELENBP1)在内的6个蛋白差异表达。在30例ALT和28例DDLPS病例中使用免疫组化证实WDLPS中SELENBP1表达明显低于ALT。SELEBP1在生理条件下的作用还未明确，但是它在癌组织中表达减少，因此它可能对肿瘤具有抑制作用。综上所述，McClain等人的研究加强了SELENBP1作为候选肿瘤抑制因子在驱动间充质肿瘤去分化中的潜在作用，可以促进例如LPS等间充质肿瘤的去分化。
这些原理性验证研究表明，蛋白组学有望加深我们对LPS的了解，尤其是发现与血管生成和去分化相关的潜在驱动分子。然而，为了描述这些蛋白的生物学作用，并将这些发现转化为强有力的临床应用，仍有许多工作要做。
平滑肌肉瘤（LMS）由平滑肌细胞或平滑肌分化间细胞所构成的恶性肿瘤，约占成人STS的10-20％。组织学上以梭形细胞为主，伴有钝端，胞浆呈嗜酸性。
LMS好发于中老年，通常发生在血管或消化器官的平滑肌壁中，而子宫LMS（uLMS）主要来源于子宫肌层的平滑肌细胞。LMS和uLMS都具有复杂的核型，在染色体水平上没有一致的遗传基因。尽管基因组的情况复杂，但已有文献已经确定抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）所在染色体13q区域和肿瘤抑制基因RB1所在染色体10q区域的缺失出现更为频繁。此外，对LMS和uLMS队列的全外显子测序分析证实了遗传异制性，但肿瘤抑制基因RB1、TP53、PTEN和基因E型钙粘连蛋白基因(CDH1)中拷贝数变异出现更为频繁。癌症和肿瘤基因图谱对206例STS样本（包括80例LMS患者样本，其中53例软组织LMS和27例ULMS）进行了全基因组测序，DNA甲基化，信使RNA和microRNA研究。、报告显示与其他STS亚型相比，软组织LMS和uLMS更加相似，然而，他们确定了两个LMS组之间明显的甲基化和mRNA表达谱，非子宫LMS显示出更明显的HIF-1α信号传导，而uLMS显示出更高的DNA损伤反应。转录组学研究揭示了LMS的三种分子亚型：1个mRNA主要定位到uLMS，另外2个存在于混合亚型中。尽管其他类型癌症的蛋白-基因组研究经常注意到在单个蛋白水平上缺乏mRNA-蛋白的相关性，但LMS相关研究分析也表明了三种LMS亚型的存在。Kirik等通过2D-DIGE对38例LMS和16例未分化多形肉瘤(UPS)进行研究发现存在三个LMS蛋白亚群，以及一个是UPS蛋白富集亚群。为了进一步深入全面地分析肿瘤蛋白组学，采用基于TMT的ESI-MS/MS对每个鉴定亚组中的5个样品进行了定量分析。结果，至少一个样本有778个蛋白被量化，并且鉴定出三个蛋白的水平在4组间存在差异，即VINC，COL6A3和MYH11。这些发现表明蛋白组学不仅有助于提高对疾病病理生理学的理解，而且有助于区分STS不同亚型的异质性。
除了肿瘤样本图谱外，还对uLMS肉瘤细胞系MES-SA进行了蛋白组学分析，目的是确定导致一线化疗药物阿霉素产生耐药的分子机制。使用2D-DIGE和MALDI MS，对阿霉素干预的MES-SA细胞进行了蛋白组学定量分析。这项分析揭示了经阿霉素急性短期干预后87个蛋白的表达发生了改变。May等人为了研究患者长期对阿霉素耐药的原因，长期使用阿霉素以剂量递增的方式干预阿霉素耐药细胞MES-SA/DxR，通过2D-DIGE和MALDI MS对其进行蛋白组学分析，研究表明有208种蛋白差异表达。基因本体论分析表明了在MES-SA/DxR细胞中上调的差异表达蛋白与新陈代谢相关。相反，与细胞增殖、基因调控和信号转导相关的蛋白表达下调。综上所述，阿霉素急性治疗和获得性耐药的蛋白组学图谱显示了从早期接触阿霉素到建立稳定阿霉素耐药细胞过程中耐药相关蛋白的变化。这些研究有助于解决临床上存在的阿霉素耐药情况。
上皮-间质转化（EMT）以及间充质-上皮转化（MET）描述了与细胞系相关的整体变化，两者都在上皮来源的恶性肿瘤中被广泛研究。这些表型改变可能会导致更具侵略性的肿瘤发生，从而导致预后不良。越来越多的证据表明肉瘤中存在EMT/MET，有研究表明其生物学特性与临床存在相关性， 但这仍存在争议。Yang等人对31个LMS和38个GIST手术切除患者样本进行了转录和蛋白组学分析，并揭示了MET在LMS中的潜在作用。使用RPPA和基因微阵列分析发现在LMS患者的一个子集中观察到上皮间质转化标志物E-钙粘蛋白过表达以及E-钙粘蛋白抑制蛋白Slug低表达。此外， E-钙粘蛋白高表达和Slug低表达与OS改善相关，提示这些蛋白可以作为LMS的预后标志物。为了验证蛋白组学结果，我们对不同样本进行IHC分析，并证实E-钙粘蛋白表达与OS改善相关。转录组学数据也证实了这一点，确定了LMS中的上皮基因的表达特征。为了评估LMS中MET的功能，使用RNAi下调LMS细胞系SK-LMS-1中Slug的基因表达，结果显示E-钙粘蛋白高表达，间质标志物(vimetin和N-cadherin)蛋白低表达，同时伴有肿瘤细胞增殖和迁移的减少。随后诱导该蛋白高表达，从而为该蛋白在LMS中高表达介导的MET提供了依据。在分析的GIST样本中没有观察到E-钙粘蛋白的高表达与患者生存率之间的关系，这强化了不同STS组织亚型所固有的独特生物学特征。
恶性横纹肌瘤（MRT），易发生在中枢神经系统，又称为非典型性类畸形/横纹肌瘤（AT/RT），是罕见且高度侵袭性的肿瘤，主要发生在软组织，肾脏或大脑中，好发于婴幼儿。易早期转移，5年生存率只有27-33％。组织学上，MRT的特点是细胞具有典型的横纹肌样形态，包括细胞核偏心，核仁突出，嗜酸性细胞质和包涵体。细胞遗传学和分子分析证实了染色体22长臂(22q11.2)缺失，之后有研究表明，SWI/SNF相关、基质相关联的肌动蛋白依赖性染色质调控子亚家族B成员I蛋白（SMARCB1）存在功能丧失的外显子突变。MRT和AT/ RT的治疗是多模式的，化疗，放疗和手术相结合对这些患者的治疗均具有重要作用。然而，即使采用强化治疗方案，其生存率仍然很低，同时3岁以下的患儿生存率相对更低。
SMARCB1是SWI/SNF ATP依赖的染色质重塑复合物的核心亚单位，突变失活是导致MRT和AT/RT发生的分子机制。此前已有报道表明在SMARCB1缺陷性的小鼠细胞中，AKT激酶的激活有助于细胞致瘤。然而，导致SMARCB1缺失的AKT活化机制尚未明确。因此，利用MS进行定量磷酸化蛋白组学分析来比较SMARCB1缺陷性小鼠MRT肿瘤细胞系365和转导了SMARCB1逆转录病毒载体的SMARCB1细胞株365，研究表明有3655个蛋白差异表达，其中407个蛋白在SMARCB1的异位表达时，在616个磷酸化位点上显示出不同的磷酸化状态。为了识别参与蛋白磷酸化的特定激酶对差异蛋白进行富集分析，与先前研究结果一致，在SMARCB1缺失的细胞中Bad，Cdc25B和TSC2等KT的靶点显著富集，ERK1/2和JNK1靶点蛋白较少富集。进一步研究表明EGFR(磷酸化Y1197)高表达，这是一个与受体激活相关的自动磷酸化位点，SMARCB1缺失后同时伴磷酸化ERK2(T183)、Jun(S63)和MYC(T58)蛋白差异表达。随后，用EGFR特异性抑制剂吉非替尼和双靶向EGFR/ErB2抑制剂拉帕替尼处理小鼠横纹肌样细胞167、365来研究EGFR激活的信号转导。两种药物均降低了AKT的磷酸化水平，这表明SMARCB1缺陷性细胞中EGFR-AKT信号通路激活，突出了EGFR抑制剂在治疗MRT和AT/RT中的潜在作用。任何一种药物处理后磷酸化AKT低表达，提示在SMARCB1缺陷性细胞中观察到的AKT激活中存在EGFR信号轴，突出了EGFR抑制剂在MRT和AT/RT治疗中的潜在用途。
用于治疗肉瘤的几种酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已被批准用于临床治疗或正在进行临床研究。大致可分为两种TKIs，包括帕唑帕尼（Paz）是c-KIT，PDGFR，成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）的抑制剂，而达沙替尼（Das）是PDGFR，BCR-ABL和Src家族激酶的抑制剂。Wong等人通过酪氨酸磷酸化蛋白组学来研究MRT细胞系A204与PAZ耐药(PazR)和Das耐药(DasR)相关细胞之间差异蛋白表达。结果表明，与DasR和PazR细胞相比，对TKI敏感的A204细胞PDGFR mRNA和磷酸化FGFR1蛋白高表达。此外，、对PDGFR抑制剂耐受的细胞被证明对FGFR1抑制剂敏感。联合应用PDGFR1抑制剂和Paz或Das，或者是双重抑制剂帕纳替尼对PDGFR和FGFR1进行双重抑制使得细胞凋亡增加，因此抑制PDGFFRα和FGFR1被证明是克服TKI耐药的一种可行方法。Vyse等人在这项研究的基础上，比较了A204细胞对Paz或Das耐药相关的信号通路。通过对A20细胞进行磷酸化蛋白组学分析，结果显示Paz和Das耐药细胞中被量化的磷酸化位点的比例极低(分别为6%和9.7%)。PazR细胞中，细胞骨架通路磷酸化上调。具体地说，肌动蛋白结合蛋白、含LIM结构域的蛋白和含钙蛋白同源结构域(CDH)的蛋白表达显著上调。相反，在DasR细胞中胰岛素受体/胰岛素生长因子1R(IGF-1R)通路的磷酸化上调。乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)、A-Raf原癌基因(ARAF)、脂肪酸合成酶(FASN)、胰岛素受体底物1(IRS1)、cAMP依赖蛋白激酶1B/2B(PRKAR1B/2B)、核糖体蛋白S6激酶A1/B1(RPS6KA1/B1)和SHC转化蛋白(SHC)构成了一个完整的蛋白-蛋白相互作用网络，形成了胰岛素受体信号通路。这两部分研究结果仅有部分重叠，只有一小部分磷酸化蛋白上调(2.8%)或下调(1.9%)，这是对之前研究结果的补充，同时表明PAZ和DAS耐药机制是存在差异的。本研究对耐药导致的信号改变提供了一个全面的认识，并为改善患者耐药情况提供了新的方向，有助于以改善临床耐药情况。
黏膜纤维肉瘤（MFS）是影响老年人最常见的STS亚型之一，无性别分布差异，多发于66岁。MFS通常会影响四肢和带骨，浸润性生长且术后复发率高，癌细胞沿导管或筋膜间隙蔓延。尽管MFS的细胞遗传学分析少见，但已证明它们具有较高的基因变异性，具有拷贝数变异、克隆和非克隆畸变的高度复杂的核型。最近研究表明，9号染色体的非随机丢失，甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)和CDKN2A/CDKN2B基因(9q21.3)的缺失与MFS侵袭性增加有关。虽然手术切除仍然是治疗MFS的主要方法，但MFS的浸润性会扩散肿瘤边缘以外，因此需要尽可能全部切除。即使采用这种治疗方法，仍有50%以上的MFS病例存在局部复发的风险，复发的病变通常比原发肿瘤级别更高。
为了探索MFS中驱动侵袭的主要因素和识别可能受治疗抑制的生物学机制，2D-DIGE已被用于描述不同内在侵袭性的MFS肿瘤。通过磁共振成像（MRI）来检查MFS肿瘤边缘是否具有尾征来判断其浸润性是否存在。对6个侵袭性肿瘤样本和5个非侵袭性肿瘤样本进行蛋白组学分析结果显示有47个蛋白差异表达。值得注意的是，网柄菌凝素，CUB和LCCL结构域蛋白2(DCBLD2)在侵袭性患者样本中显著上调。已有报道表明在其他几种癌症类型中DCBLD2与致瘤活性相关，因此对高表达的DCBLD2与MFS侵袭性之间的相关性进行进一步研究。另外21例MFS的IHC证实DCBLD2表达与肿瘤侵袭性有关。此外，研究表明DCBLD2作为侵袭性表型的预测因子具有87.5%的高度特异性，突出DCBLD2有助于对侵袭性和非侵袭性病变进行分层
ASPS是一种极其罕见的肉瘤亚型，约占所有STS的1%，以女性为主，多发于30岁左右。虽然早期无明显症状，但ASPS具有早期转移的特性，诊断为IV期的仅有55%病例，其5年生存率为61%。ASPS的特征是t(X;17)(p11:q25)非平衡、非交互式易位，17号染色体肺泡软组织肉瘤染色体区，候选基因1 (ASPSCR1)融合到X染色体转录因子结合IGHM增强子3。在ASPSCR1-TFE3融合中，保留了TFE3的DNA结合和转录激活区域，通过其融合ASPSCR1的普遍高水平表达，证实TFE3是ASPS的致癌的驱动因子。
Kubota等人对12例ASPS病例进行了2D-DIGE MS研究，发现145个蛋白在匹配的正常和肿瘤样本之间存在差异表达。在这些差异表达的蛋白中，我们进一步研究了肿瘤抑制蛋白磷酸酶2 (PP2A)的抑制剂SET，与正常组织相比，IHC在15例ASPS病例中证实SET蛋白高表达。此外，通过基因敲除ASPS-KY细胞研究了SET在肿瘤中的作用。SET沉默导致细胞增殖、侵袭和迁移的减少，暗示该蛋白是ASPS肿瘤发生的驱动因素。此外，在加入用于治疗多发性硬化症的PP2A激动剂FYN720后也能观察到这一结果，为PP2A和SET参与ASPS提供了依据，并突出FYN720治疗ASPS的潜在作用。
除了用蛋白组学对单个亚型肉瘤进行研究外，一些报道还对多种亚型进行了综合研究。无论是在发现新的还是验证已有的生物标志物研究中，对不同亚型患者进行队列研究结果均具有差异性。此外，综合研究能够比较不同亚型之间的相似性和差异性；有助于更加详细地了解癌症的生物学特征。迄今为止最大的综合蛋白组学研究是由癌症基因组图谱研究网络进行的。在173例样本中使用RPPA对192种蛋白表达进行研究，其中包括60例LMS、46例DDLPS、41例UPS、15例MFS、6例SS和5例MPNST。对这个结果进行分析识别出5个稳定的分子团簇，其中1个富集在LMS中(53个样本中有48个是LMS)，其余4个在其他亚型中富集。值得注意的是，与其他4个聚类相比，LMS富集的聚类表现出更低的凋亡通路活性，更高的PI3K/AKT通路活性和雌激素、孕酮受体表达。进一步数据分析表明，AKT活性在非子宫LMS中富集，而uLMS中激素受体高表达。
在另一项针对多种STS亚型的大型比较研究中，Lou等人利用MALDI MS对MFS、骨肉瘤、LMS和UPS进行研究。科研工作者对52例高级别恶性骨肉瘤、LMS和UPS病例进行分析发现蛋白组可以对不同亚型进行区分。该研究还证实包括蛋白酶体(PSME)等在内的9种蛋白表达与除骨肉瘤外的所有亚型低生存率有关。最近，对10例MFS、7例骨肉瘤、8例LMS和8例UPS患者的代谢物相关研究对这些结果进行了补充。MALDIMS被用于代谢分析，由此产生的代谢产物图谱显示了每个亚型的特定特征。当结合临床数据时，这些数据强调环磷酸肌醇和肉碱作为代谢产物与低OS和无转移生存期(MFS)相关。已有报道肉碱和环磷酸肌醇都与肿瘤的发生有关；前者在结肠癌研究中被报道，而肌醇环磷酸参与的三磷酸肌醇(IP3)信号异常传导在急性髓系白血病中已被报道。
这些研究证明蛋白组学的综合分析有助于对不同亚型肉瘤进行研究，并显示了在亚型内部和亚型之间具有不同生物学特性的分子亚群。此外，研究人员还鉴定出几种能够标志疾病进展的蛋白和代谢产物。这些研究强调对肉瘤不同亚型进行大规模综合分析具有巨大的应用前景，能够弥补我们在病因学和病理生理学方面的研究空白。
4. 挑战和未来展望
近年来，关于蛋白组学的不同方法已经应用到肉瘤研究中，涉及多种组织学亚型，这其中也包括几种超罕见的亚型。尽管已经取得了这些进展，肉瘤的蛋白组学研究仍处于初级阶段。虽然目前蛋白组学主要用于发现肉瘤的生物标记物和进行全球图谱分析，但是蛋白组学的巨大潜力远不止于此。
肉瘤界在临床疾病管理方面面临几个关键挑战。目前，肉瘤治疗方法缺乏，50%的患者在手术切除局部肿瘤后仍然复发，并出现无法治愈的转移性病变。以前，“一刀切”的治疗方法限制了治疗方法的优化，因此无论何种亚型的肉瘤都需要使用化疗，但由于肉瘤的高度异质性，各种亚型对这些化疗的反应率差异很大。因此，迫切需要根据临床疗效来开发更有效的靶向治疗方法和发现生物标记物，以便进行患者分层。此外，临床研究迫切需要发现新的的预后生物标记物，以预测局部肿瘤存在情况下进行手术治疗疾病复发的风险。另一个关键的临床问题是患者对化疗和靶向药物产生耐药性的问题，虽然药物治疗初期疗效显著，但这种显著的效果只能维持短暂的时间，随后会出现明显的耐药现象，在这个阶段，治疗方法不再有效，而且还会导致疾病的恶化。
这些挑战突出了我们对肉瘤发病机制和治疗反应基础生物学认识的不足。具体来说，蛋白组学可以在我们需求的三个领域发挥重要作用。首先，我们不完全了解驱动肉瘤发生和进展的过程中的分子机制。第二，没有已被验证的能够预测疾病复发和治疗效果的的生物标志物。第三，缺乏对耐药机制的了解。例如，由蛋白组学进行的综合分析有助于深度注释和描述与肉瘤发生和耐药性相关的生物学途径，这能够为疾病的临床前模型提供参考。此外，磷酸化蛋白组学有助于揭示由异常激酶信号驱动的关键磷酸化信号节点。除了单独使用蛋白组学外，组学数据集成也正在发展。大规模的多组学研究正在进行，例如由癌症基因组图谱和临床蛋白组肿瘤分析联盟进行的研究提供了肿瘤最全面的肿瘤组学分析，这些结果如果扩展到大型肉瘤患者临床队列研究中将具有巨大的潜力。在大数据时代，随着这样的数据集的扩大，越来越需要使用机器和人工智能的方法进行数据挖掘，以识别有助于预测疾病易感、复发和预后的多特征生物标记物。这一策略应该超越对侧写数据的分析，并与成像和数字病理学等其他临床诊断方法进行结合来推动肉瘤研究领域的新发现。
蛋白组学通过肉瘤临床实验来推动个性化分子药物治疗，通过对疾病进展、治疗、获得耐药和疾病复发时的组织和血液进行蛋白组学分析有利于推动对肿瘤的综合研究。我们希望在临床实验中将蛋白组学与相关科学进行常规集成来增强我们综合分析疾病生物学的能力，这有利于推进疾病的早期诊断和临床检测。
结论
