科研 | New Phytol.：根中碳水化合物的消耗阻碍了幼树中的磷营养
编译：张方博，编辑：Emma、江舜尧。
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营养失衡导致欧洲森林树木健康状况恶化，但其潜在的生理机制尚不清楚。该项工作研究了减少根系碳水化合物储量对森林树木活化和吸收磷的影响。在磷充足（HP）和磷匮乏（LP）的山毛榉林中，对比环剥幼树与未环剥幼树有机质层和矿质表土层中与磷的活化相关的根系、菌根和微生物活性。环剥后，根系碳水化合物储量减少。根系中连接碳和磷代谢的枢纽——磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC酶）活性增强。根和外生菌根磷酸酶活性以及催化磷周转主要步骤的细菌基因丰度都增加，但参与磷活化的土壤酶未受影响。磷匮乏区幼木对环剥的生理响应强于磷充足区幼木。环剥后磷的吸收显著降低，根中可溶性磷和总磷含量稳定，但是细根生物量降低。
本文研究结果表明，碳水化合物的消耗会减少磷的吸收，增强内部磷的转运以及根系生物量的权衡来补偿磷的短缺。由于根系生物量的减少使树木更容易受到干旱的影响，该研究表明林木退化与地下碳水化合物分配减少导致的磷供应紊乱有关。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 环剥降低了根系碳水化合物的含量，激活PEPC
环剥后细根的非结构性碳水化合物浓度(以淀粉、葡萄糖、果糖和蔗糖的总和来确定)下降(图1)。总的来说，有机层中的根在环剥一周后碳水化合物浓度已经显著降低(F=48.19，p <0.001)；这种现象在磷充足森林中尤为明显(交互作用F=15.99，p=0.002，图1a)，而在矿物层的下降不太明显(F=4.74，p =0.064，图1b)。八周后，HP和LP森林的两层土壤中，环剥根的碳水化合物含量均显着低于未环剥树木的根（图1a，b）。
图1 高磷（HP）和低磷（LP）森林中的山毛榉树环剥细根（G，浅色）和未环剥细根（C，深色）中碳水化合物的浓度（mg·g-1·dw）
在环剥后一周(1wk)和八周(8wk)分别分析来自有机层(a)和矿物表层土(b)的根。数据表示平均值(HP:n = 3，LP:n=4)±SE。为了确定森林类型、取样日期、处理的影响，使用以地块为随机因子的线性相互作用混合效应模型（“lmer”），并进行事后Tukey HSD检测均值之间的差异。不同的字母表示p ≤ 0.05时的显著差异。条形的颜色是指淀粉(绿松石)、葡萄糖(红色)、果糖(绿色)和蔗糖(橙色)。
总的来说，HP区有机质层细根碳水化合物的浓度高于LP有机质层(F= 70.20，p<0.001)，而在矿质层未发现显著性差异(F=0.05，p=0.822)。碳水化合物浓度不受季节影响(有机层:F=3.14, p=0.088,矿物表层土:F=0.12, p=0.730,环剥后第一周和第八周取样分别对应于夏季(7月)和早秋(9月)，HP区矿质层除外)。
由于环剥在8周后表现出最显著的效果，我们用这个时间点来测试碳消耗对根中PEPC活性的影响。我们发现，在两个研究地点的两个土壤层中，与对照树（不环剥）相比，环剥树根部的PEPC活性显著增加(所有地点条件下的平均值+26.4%，F=37.36，p<0.001，图2)。
图2 高磷（HP）和低磷（LP）森林中，山毛榉树环剥细根（G，浅色）和未环剥细根（C，深色）中PEPC活性（μmolg-1 fw h-1）
分别分析了来自有机层(a)和矿物表层土(b)的根。数据表示平均值(HP:n =3，LP:n =4) ±SE。使用线性混合效应模型(lmer)，以地块为随机因素，确定了森林类型，处理和它们的相互作用的影响，并采用Tukey HSD检测平均值之间的差异。不同的字母表示p ≤ 0.05时平均值的显著差异。
2. 环剥可提高根系和EM真菌中酸性磷酸酶的活性，但对土壤中微生物P的活化具有中等影响
本研究测定了细根内的酸性磷酸酶活性、菌根菌丝的胞外磷酸酶活性和土壤中的酸性磷酸酶活性，以探究环剥是否影响山毛榉根系或土壤中磷的活化吸收。我们还测定了土壤微生物中磷相关酶的基因丰度。由于这些变量在HP和LP区之间以及不同土层和取样时间之间存在差异，因此我们通过研究环剥/对照处理的响应率来关注环剥效应。
环剥后，无论在哪个土壤层或取样时间，LP区域的根系磷酸酶活性的响应率均持续提高，而环剥后一周，HP区域有机层的根表现出较强的增强作用，环剥后八周，HP区域矿物层土壤的根表现出中度增强（图3）。
环剥进一步增强了LP区域两个土层中外生菌根胞外磷酸酶响应程度(图3 b，d)，但在HP区中没有(图3a，c)。根尖的外生菌根定植和外生菌根真菌的群落组成不受环剥的影响（ANOSIM：R²=0.418，p>0.05），环剥后8周，除LP区的矿物层土壤外，其余样品中菌根种类的丰富度平均从10种减少到5种。HP和LP区域的菌根真菌种类组成不同(ANOSIM: R2=0.135p≤0.05)，两个取样时间点的菌根真菌种类组成不同(ANOSIM: R2=0.988,p<0.05)。
图3 环剥与对照的酸性磷酸酶活性响应率
条形图显示了环剥/对照中山毛榉细根(根)、菌根(EMF)、根际(Rhizo)和土体土在环剥后一周(黑色)和8周(白色)中磷酸酶活性的响应率(μmol·g-1·鲜重 * h-1)。测定了HP(a)和LP(b)有机层以及HP(c)和LP(d)矿物层土壤中磷酸酶活性的响应率。数据表示响应比的平均值（HP：n=3，LP：n=4）±SE。通过Student’s paired对环剥和非环剥处理进行t检验，并以星号表示（* p≤0.05，**p≤0.01，*** p≤0.001）。柱上的黑色方块表示边际差异(p≤0.10的趋势)。对照用虚线标记。nd=无法获得。
与根和菌根不同，根际土和土体土中酸性磷酸酶活性的响应率不受环剥的影响(图3)。类似地，酸性磷酸二酯酶(pH6.1)和碱性磷酸酶活性(单磷酸酯酶pH 11)对环剥的响应没有增强。同样，在HP有机质层或矿质层土壤中，没有检测到微生物磷活化基因丰度的变化(图4a, c)。在HP区的土壤中，只有gcd和pitA对环剥出现延迟响应(图4a)。与HP区的土壤相比，在LP区中环剥后一周，土壤微生物的磷转运蛋白和磷矿化的基因(pitA、pstS、phoD、phoN、phnX)拷贝数的响应率显示出短暂的增加(图4b)。这种现象仅出现在有机层，而在矿质土壤中这些基因对环剥均未表现出显著响应(图4d)。总的来说，HP和LP区森林土壤的相关基因(pitA、pstS、appA、phnX、phoD、phoN、gcd)丰度差异很大，HP区两个土层(有机层:F=58.84，p<0.001，矿物表层土:F=9.93，p=0.005)的基因拷贝数均高于LP区。
本研究没有发现环剥对细菌和真菌生物量的PLFA生物标记物有任何显著影响;HP（高磷）区土壤中驱动磷周转的基因拷贝数高于LP（低磷）区，同样HP区土壤中的微生物生物量也高于LP区土壤。
此外还测定了与碳或氮矿化有关的土壤酶活性，并未发现对环剥的显著响应。然而，有机层的根际土中许多与碳相关的酶在环剥后8周表现出活性增加的趋势。
图4 与非环剥对照相比，环剥后土壤微生物的磷转运蛋白(pitA，pstS)、磷矿化(phoD，phoN，phnX，appA)和Pi活化(gcd)的基因丰度的响应率
条形图显示的是山毛榉幼苗环剥/对照后一周(黑色)和8周(白色条形图)的测定响应率。在HP区(a)和LP区(b)的有机层中，以及在HP区(c)和LP区(d)的矿物土层中，测定了响应率。数据表示响应比的平均值（HP：n=3，LP：n=4）±SE。通过Student’s paired对环剥和非环剥处理进行t检验，并以星号表示（* p≤0.05）。柱上的黑色方块表示边际差异(p≤0.10的趋势)。对照用虚线标记。bt=低于阈值。
3. 根系和土壤中磷浓度稳定，而根系生物量和磷吸收下降
环剥不影响土体土、根际土中总磷（Ptot）和可溶性磷（Psol），以及微生物量磷（Pmic）浓度（表1）。除HP区有机土层细根中的可溶性磷外，其余处理中根的磷浓度也不受环剥的影响(表1)。HP区有机土层细根中的Psol可在环剥后一周下降约两倍（F=25.26, p=0.037），但是最终P含量仍高于LP区中细根P浓度（0.18 ± 0.02 mg·Psol·g-1干物质,表1)，下降现象在第8周时恢复。
表1 HP和LP区森林土壤pH，水溶性有机碳（WEOC），及不同土壤和根系中多种形式P的含量数据
研究发现，环剥降低了根系生物量，尤其在LP区。环剥后根系中P含量显著降低（图5）。在HP区森林中，环剥后前期下降不明显，8周后显著降低，而在LP区森林中，在环剥后一周已经明显出现了强烈的降低（图5）。虽然细根生物量因响应环剥而减少，但其余根的根尖部分在早期不受影响，环剥后8周仅略微下降（-7％）。与根相比，环剥对土壤中磷含量和Pmic含量没有影响。
图5 环剥(G，浅色)和非环剥对照(C，深色)山毛榉树土壤中细根(mg·m-2)中的磷含量
对HP区和LP区样品进行了测定
分别分析了环剥后一周(1wk)和八周(8wk)有机层(绿色)和矿质表层土(橙色)的细根。（HP：n=3，LP：n=4）±SE。使用线性混合效应模型(lmer)，以地块为随机因素，确定了森林类型，处理和它们的相互作用的影响，并采用TukeyHSD检测平均值之间的差异。条形上方的不同字母表示p≤0.05时的显著差异。
为了清楚根系磷的吸收是否受到环剥的影响，我们在控制条件下对山毛榉幼树进行了独立的标记实验。环剥一周后，山毛榉树的根暴露在33Pi的人工土壤溶液中。环剥样品的33Pi吸收仅为非环剥样品的一半(图6)。在环剥和非环剥幼树中，总的33P吸收量的大约20%存在于运输段(不与标记溶液接触)，表明环剥减少了磷的吸收，而不是转运(图6)。
图6 环剥(G，浅色)和非环剥对照(C，深色)山毛榉在环剥后一周的33P吸收量(Bq·mg-1·dw·h-1)
测定了暴露于标记溶液的根段(暴露)及其上端部分(运输)的吸收情况。数据表示平均值(n= 7) ±SE。使用线性混合效应模型(lmer)，根数作为随机因素，确定了处理效果和根分数的影响。并采用Tukey HSD检测平均值之间的差异。上方的不同字母表示p≤0.05时的显著差异。
讨论
1.碳水化合物消耗影响磷的活化和植物磷的供应
该项工作研究了森林土壤中根源碳水化合物资源，磷的吸收和磷的活化之间的联系。与先前的研究一致，环剥使细根中的可溶性糖特别是淀粉大量减少。环剥几乎完全阻断了树冠的碳供应；因此，细根的新陈代谢必须依赖于储存的化合物。我们研究的一个重要的新发现是，环剥后一周内，这些反应在上层土层相对较快地发生，并且与淀粉含量较少的根系相比，这种现象在淀粉含量较高的根系中更明显。这一发现表明高磷（HP）森林中树木是补偿性资源利用，而低磷（LP）森林中由于资源匮乏，无法补偿利用。因此，LP地区的幼树，其根系碳水化合物含量和磷含量较低，其根系生物量损失比HP地区的大。团队早期研究发现LP土壤中树木的光合作用速率受到抑制，通过施磷可以缓解该现象，这表明LP森林中光同化物的利用率比HP低是由于P限制所致。为了应对低磷胁迫，山毛榉树依靠体内磷再利用并相应地调整自身生长。因此，在我们的环剥研究中观察到糖的减少以及根生物量的急剧减少，都是在磷胁迫条件下生长的幼树的典型情况。干旱和落叶等环境压力阻碍了光合产物分配到根系，造成碳水化合物储量减少和根系生物量损失;这些现象与环剥相似。根据这些观察结果，该研究结果表明缺磷可能会加剧其他环境胁迫的发生。
我们最初假设，环剥会加剧山毛榉碳水化合物的消耗，从而导致根系P含量的降低，是因为对模型植物（胡杨和拟南芥）的研究表明，蔗糖是响应缺P反应的中心调节剂，调控P相关基因的表达。在磷饥饿发生初期，韧皮部负载和向根部转运蔗糖的过程就会增强。除了增加磷转运和细胞内酸性磷酸酶活性外，磷饥饿还增加了编码用于三羧酸循环回补反应的酶的基因转录。例如，在缺P的杨树中，PEPC在转录丰度和酶活性水平上都会显著增强。PEPC是一种严格调节的初级碳代谢酶，可补充三羧酸（TCA）循环。在拟南芥中，PEPC的上调会导致淀粉减少，而敲除基因的突变体中淀粉累积。在这个环剥试验中，淀粉的减少和PEPC的增加，以及酸性磷酸酶的增加是能量消耗和缺磷的信号，与Plaxton和Tran描述的P饥饿反应相似。在可控条件下的环剥试验中磷吸收的显著降低也证明了这一点。Pi的获取是通过H+:Pi转运体实现的，需要跨质膜的pH梯度，这是由ATP依赖的质子泵产生的。与植物类似，担子菌也依赖于pH驱动的H+：Pi共转运体，担子菌门真菌是寄生在山毛榉根上的主要菌根类型。因此，根的碳水化合物减少可能导致减少P获取所需的能量，并可能会中断调节磷吸收所需的蔗糖信号。
令人费解的是，尽管磷吸收减少，但根组织中的磷浓度相对稳定。转运到地上组织需要光合作用和蒸腾作用。之前的环剥研究表明，这些过程会在几个月内缓慢下降。例如，Druebert等人(2009年)发现，与未环剥的山毛榉树相比，环剥10周后的光合作用没有差异。因此，在目前的研究中，假设光合作用仍然不受影响是合理的。此外，我们还发现新吸收的磷被运输到地上部。因此根系中P浓度的稳定性不太可能是由于地下部向地上部磷转运减少的结果，而是通过生物量的权衡和下降根的磷吸收共同实现的。
2. 环剥对山毛榉土壤磷有效性影响不大
碳水化合物向根系输送的中断减少了根沉积进而影响土壤过程。土壤中的活性碳和微生物活动随着环境条件、季节、离根的距离和环剥时间的变化而剧烈波动，因此很难在不同的研究中进行比较。一些研究观察到环剥后不久活性碳减少或发生短暂的变化。Kaiser等人说，在环剥后的第二年，生物量降解酶的活性增强，但第一年没有。因此，我们发现对不稳定磷、土壤中的可溶性碳以及与凋落物降解相关的酶只有微小的影响或没有影响也就不足为奇了。
一个值得注意的结果是根际土壤中的Ptot和Psol始终高于土体土壤，这可能会影响微生物磷酸酶活性对环剥的响应。但是，在LP森林的有机层中， Psol浓度比HP的低了将近十倍，环剥短暂的影响了细菌磷的活化，这催化了磷转化的主要步骤。我们推测这种活化可能与根的强烈竞争和缺磷条件下有机层中菌根对磷的高吸收效率有关。因为基因丰度取决于微生物群落的组成，微生物群落受植物碳的强烈影响，可以想象，环剥后初期微生物对环剥作出响应，随后群落组成发生变化，以适应环剥环境。
本研究着重于菌根真菌群落结构。与以前的研究一致，HP森林和LP森林之间有很大的差异，但在每个森林生态系统的有机层和矿质表土层中的真菌群落之间没有差异，菌根真菌群落结构显示出季节性变化。在早秋LP森林的矿质土层中，环剥导致菌根真菌物种组成减少，其根尖密度最低，对植物磷供应的贡献最小。Pena等人证明，成熟山毛榉树环剥后保留了丰富的菌根真菌物种，丧失的只是小部分的稀有物种。
外生菌根真菌是土壤中酶的重要生产者。温带森林土壤中高丰度的外生菌根真菌和它们在环剥后早期阶段的稳定组成可能是本项研究中酶活性相对稳定的原因。这些结果与以前的研究一致，表明最初很少或没有变化，但在环剥后大约一年的延迟时间内，降解有机物的酶活性显著增加。然而，在成熟山毛榉树环剥后的第一年内，已经观察到根碳水化合物显著减少。因此，尽管根系中储备了大量碳水化合物缓冲，但长期干旱可能会限制碳水化合物的产生和地下分配，也会降低成熟树木对磷的吸收。总之，我们的研究表明，与土壤中P的滞留过程相比，幼树和相关外生菌根对磷的吸收和代谢更容易受到碳水化合物短缺的影响。土壤、微生物、根际和根系磷水平都没有变化。然而，环剥导致碳水化合物消耗减少，导致根对磷的吸收减少，这表明根系磷的稳定是通过根系生物量降解过程中磷的循环来维持的。缺磷条件下，消耗碳水化合物的负面后果很严重。这些结果很重要，因为它强调了缺磷的树木比营养良好的树木更容易受到胁迫。因此，面对更热更干燥的气候，以及高氮沉降造成的营养失衡的未来，我们的结果对森林碳和磷循环具有关键意义。