科研 | 巴斯德研究所：自闭症患者松果体蛋白质组昼夜差异的质谱分析
编译：向阳而生，编辑：Tracy、江舜尧。
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人类松果腺可调节多种生理学过程的昼夜节律，特别是分泌褪黑激素。采用基于质谱的蛋白质组学以及一些精细的分析工具，我们在人类松果腺中鉴别出了一些蛋白，系统的分析了其在一天中的变化，并在自闭症患者供体和对照的样本中比较了松果腺蛋白质组的变化，结果显示出多种参与调解的蛋白质基团、催化碳水化合物代谢过程以及细胞膜结合的囊泡相关蛋白在夜间和白天的差异和/或在对照组和自闭症组个体间的差异。这些数据显示出在昼夜节律下人类松果腺中发生的一些新的和意想不到的过程以及在自闭症供体的松果腺以及对照组松果腺中的特定的差异。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 来自人类松果腺蛋白基因的功能富集分析
我们通过GO分析检测了松果腺的蛋白质组成。我们在富集分析中采用了两种计算方法，首先，我们在质谱分析中包含了所有蛋白（非0；如，具有LFQ > 0的蛋白质）并采用全转录组作为背景，采用此策略，我们检测出51条高度富集的通路（q值 < 0.01）。根据其在松果腺中的功能相关的7条通路为：线粒体包膜、色素颗粒、氧化还原作用、细胞质膜结合囊泡、物种间的相互作用、氧化还原酶CH-OH组的供体、蛋白泛素化正向调节通路，然后我们采用了一个更加严谨的筛选标准，仅仅保留在人类松果体中具有最高丰度的蛋白质（1SD；即，具有LFQ Z评分 > 1的蛋白，见材料与方法），采用第二种方法，我们鉴别出5种富集的GO基因簇（图1）：碳水化合物催化过程（GPI，TPI1，MDH1，MDH2，PGAM1，ENO1，ENO3，HK1，LDHB，LDHA，PKM，PGK1，ALDOC，ALDOA，GAPDH，PFKM，PGD，ATP5O，GOT1，GOT2，HADHB，ACLY，GLUD1，HADHA），未经折叠的蛋白质（ERP29，CCT5，HSPA1A，PPIB，CRYAB，HSPA8，HSP90AA1，HSP90AB1，HSPA9，CCT3，CCT2，HSPD1，PDIA6，CCT6A，TCP1，HSP90B1，CALR，CCT7，CANX，PPIA），细胞膜结合囊泡（ERP29，ATP6V1B2，P4HB，PPIB，CTSD，RAB7A，PDIA3，YWHAE，HSPA8，HSP90AA1，HSP90AB1，AHCY，HSPA5，ANXA2，CLTC，PDIA6，YWHAZ，HSP90B1，PRDX1，CANX），一氧化碳裂解酶（GLO1，ENO1，ENO2，ENO3，RPS3，GOT1，ALDOC，XRCC6，ALDOA，CA1，ACO2，HADHB，ACLY，HADHA）以及死亡编程调控的负调节因子（GSTP1，HSPA1A，GLO1，PRDX6，TF，HSPB1，CRYAB，PRDX2，CFL1，NEFL，HSPA9，HSPA5，ANXA5，HSPD1，YWHAZ，HSP90B1，ANXA1，XRCC5）。除了这些富集分析之外，与褪黑激素合成通路相关的蛋白也被检测出来，例如ASMT，肾上腺素的受体复合物，G蛋白，腺苷酸环化酶以及cAMP依赖的蛋白激酶亚基。有趣的是，没有任何β-肾上腺素受体或者AANAT，以及褪黑激素的限速酶的合成被检测出来。
2. 人类松果腺白质-蛋白质互作网络关系分析
为了研究与松果腺功能相关的信号转导通路，我们采用了来自5个顶级GO基因簇的STRING PPI网络（图2）分析了蛋白质-蛋白质互作网络（PPI），其中3个不同的高度相互连接的网络被进行了描述，包括包含伴侣蛋白的TCP1复合物（CCT）蛋白（CCT2，CCT3，CCT5，CCT6A，CCT7，TCP1），这些蛋白辅助了初期多肽的折叠并需要ATP以帮助其发挥功能。第二个网络包括热休克蛋白家族（HSPA5，HSP90B1，HSPA8，HSP90AA1，HSP90AB1，HSPD1，HSPA1A，HSPA9），其主要作用是辅助蛋白质的折叠，大多数应激诱导的蛋白在细胞被暴露于应激环境时发挥了重要作用。第三个网络包括细胞质膜结合的囊泡蛋白（PGK1，PKM，GAPDH，ENO2，ENO1，ENO3，GOT2，GPI，TPI1，PGAM1），这些蛋白在能量代谢过程中的糖酵解和糖质新生发挥重要作用，一些蛋白质参与到了诸如碳水化合物催化过程以及一氧化碳裂合酶的催化功能方面（ENO1，ENO2，ENO3，ALDOA，ALDOC，GOT1，HADHA，HADHB，ACLY），细胞质膜结合的囊泡以及蛋白质折叠（ERP29，HSP90AA1，HSP90AB1，PDIA6，PPIB，HSPA8，HSP90B1，CANX），细胞质膜结合的囊泡以及细胞程序性死亡的负调节过程（HSPA5，YWHAZ），蛋白质折叠的编程性死亡（HSPA1A，CRYAB，HSPA9，HSPD1）或者一氧化碳裂解和负调节编程性死亡（GLO1）。其他小的网络包括两种DNA互作的修复蛋白质XRCC5和XRCC6，其他两种来自线粒体功能性的蛋白质复合物HADHA和HADHB催化脂肪酸的β氧化过程（我们同样也检测了β氧化周期中的其他成员LFQ > 25：ACAA2，ACAD9，ACADM，ACADVL，ACAT1和ECHS1）。最终，过氧化物酶类（PRDX2，PRDX5，和PRDX6）均为过氧化物酶家族成员，该家族是硫基特异性抗氧化酶的保守家族成员，保护细胞免受氧化应激的损伤。这些因子贡献于多重信号转导通路，一些疾病包括癌症发生，炎症，II型糖尿病，视觉氧化损伤。
图1 在人类垂体腺中丰度最高蛋白的生物学功能
5种与蛋白质相关的GO基因簇，LFQ Z评分 > 1。GO < 10或GO >1000的蛋白质在运行富集图谱方法时从BINGO结果中被排除。颜色代表基因簇的基因大小。
3. 检测蛋白昼夜节律的表达谱
有3种计算方法被用于鉴别昼夜节律中差异表达的蛋白质（图3），由于JTK方法能够检测任何日间节律，而不仅仅是与白天的自然光完全吻合的那些光照，这使得更多受到调控的蛋白得以被鉴别（N = 782）。BGLS方法（见方法）限制在23到24小时之间，并鉴别出34种蛋白质，最终，bootstrap程序比较了白天和夜间各种蛋白的丰度并鉴别出451种蛋白质。通过多种方法鉴别出的蛋白质用韦恩图表示（图3），我们还做出了以节律性模式存在的日间（如：AGRN和IGHG2）或者夜间（如：GFAP和CDH2）的蛋白质谱（图S4），其中的蛋白质亚群通过Western blot进行证实（e.g.，GFAP，B2M）。
图2 人类松果腺的核心生物通路
采用STRING软件对富集的蛋白质网络分析。在不同蛋白质节点之间的连接线表明蛋白-蛋白互作（PPI）。图1中的5个基因簇用虚线表示。
4. 昼夜节律中蛋白-蛋白互作
受到调控最多的日间和夜间蛋白质PPI网络见图4，15个蛋白质仅仅在日间松果腺中被检测出来（LRBA，PIK3R4，JAK1，SUN1，PALLD，LMF2，SLC6A4，PDS5B，COG8，PLA2G4A，MT-CYB，CTNNA3，POLR2B，PTP4A2，PRR14L），23个蛋白质仅在夜间被检测出来（CHKB，CLIP2，NDUFB7，RFK，CLNS1A，SEC61B，B2M，SNW1，SLC30A9，PPM1G，HBSIL，MT-ATP6，HRAS，NFYB，NCAN，FGF2，MBP，NMRAL1，CLIP1，NUP155，IGTA7，F10，GLMAP4）还有33个蛋白在日间和夜间交替出现。Agrin（AGRN）是最在白天循环表达的蛋白质中上调程度最高的，接着是SLC2A1，HRG，然后是ATP1A1，NID1，COL6A1，PRKDC，CUL3，FLNA，SLC25A4以及最终DPP7，LUM，COL6A2，TGM2，MYH9，AP2M1，AP2A1，HPX，NID2，HEXB，DYNC1H1，RPN1，CLTC，XPO1，MT-CO2，ATP6V0A1，PARP1，C3，LAMB1，COL18A1，SF3B3.采用相同的方法，我们发现两种蛋白质CDH2和UBE2L3在夜间上调表达。正如图4所描绘的，大多数的上述蛋白质（70%）之间相互交联形成大的互作网络，由44个蛋白质节点和58条边组成，其中71%为日间表达的蛋白，30%为夜间表达的蛋白；另外，还有两个小的网络（C3，HPX，HRG）以及（CUL3，UBE2L3）被检测出来。CDH2通过FGF2与大的网络连接，而其它夜间表达的蛋白UB2L3与日间表达的蛋白CUL3连接，其他蛋白质在我们的结构中没有紧密的互作关系（10个日间表达，11个夜间表达）。
图4 在日间和夜间调控的蛋白质间的互作（仅针对对照组）
图中列出日间和夜间受到调控最多蛋白之间的互作网络关系。在日间或者夜间丰度更高的蛋白质由红色或者蓝色表示。而被调控的蛋白质由圆圈表示，在日间或夜间观察到的蛋白用方块表示。
5. 自闭症患者的松果腺
我们之前报道了患有自闭症的个体亚群受到褪黑激素缺乏的困扰，这可能恶化了自闭症症状并增加了之前在自闭症中报道的睡眠/节律问题的风险。本研究中，我们调查了7位患自闭症患者松果腺中蛋白质的含量并且与在对照组中鉴别出的蛋白质结果进行比较，发现共有101种蛋白在对照组中丰度更高，其中有80种蛋白甚至未在患自闭症的个体中发现，而78种在患自闭症的患者中丰度更高。有趣的是，仅有80种蛋白在对照组中被观察到，但这些蛋白在自闭症患者中都未被观察到。
富集分析表明3种类型的生物学过程在与对照组相比的自闭症组中发生了改变（图5；对于详细的PPI见表6）；细胞学过程可响应细胞凋亡、与糖类和醇类相关的催化过程，囊泡的转运过程。而大多数相关的生物学通路在自闭症患者中下调，有趣的是一些在自闭症患者中具有较高表达量的蛋白也参与了上述过程（例如：凋亡的抑制）。
图5 松果腺中的自闭症相关蛋白
圆圈代表富集的GO条目，包括上调/下调表达的蛋白。连接线代表GO条目间共享的蛋白。
在具有较高丰度的对照组所检测到的蛋白中，15种列于SFAR1数据库中，该数据库列出了与自闭症相关的基因/蛋白，其中，CNTNAP2，一种与自闭症相关的细胞联结蛋白在18个对照组个体中7个的松果腺中被检测出来，但在7个患自闭症个体的松果腺中未被检测出来。之前采用的度量ASMT酶活性样本被用于研究松果体样本，但我们在本研究中发现，尽管之前报道了低的ASMT酶活性（图S7），大多数患自闭症和缺乏ASMT酶的个体具有正常水平的ASMT蛋白，表明ASMT的数量在这些患者中并未导致酶或者褪黑素的缺乏。
讨论
1. 在人体松果腺中可能的能量产生的节律代谢的影响
我们的富集分析在代谢通路中鉴别出一些与糖酵解、三羧酸循环、五碳糖磷酸化通路、脂肪酸氧化过程有关的蛋白。我们观察到，在这些之中，存在的一些非交替表达的蛋白包括糖酵解通路中GPI，PGK，PKM，TPI1，ALDOC以及PGAM1，三羧酸循环中的MDH1，以及来源于脂肪酸β氧化过程中的HADHA和HADHB，更有趣的是，一些丰度较高的代谢过程中的蛋白质在夜间表达上调包括ENO1，LDHB，6PGD以及ATP5O。烯醇化酶是包括在糖酵解和糖质新生过程中的酶类，在ATP供应方面发挥重要作用。与我们结果一致的是，ENO1之前在夜间大鼠的松果腺中表现为上调。LDH为包括在NADH到NAD+循环中无氧糖酵解过程中的末端转移酶，6PGD包括在产生NADPH的磷酸戊糖通路过程中，其功能是在应激条件下对维持氧化还原作用的平衡，ATP5O是在线粒体呼吸链中与ATP产生相关的线粒体ATP合酶。在此通路中，之前的研究表明夜间较高水平的线粒体呼吸链酶水平，但是我们也鉴别出几种糖酵解酶类，这些酶类包括PFKM，GAPDH和HK1，它们在白天表达量上调，表明这些基因可能会影响白天松果腺中几种代谢通路的活性。总之，这些结果表明在松果腺中的能量产生在白天和夜间是协调进行的。其中一些蛋白的夜间上调表明夜间ATP产生的增加，这些蛋白可能对于松果腺中褪黑激素的夜间合成是需要的。
2. 松果腺作为抗氧化和伴侣蛋白的来源
有大量的证据表明松果腺在抗氧化和炎症方面的作用，褪黑素本身被报道是抗炎和抗氧化的制剂。数据分析同样也显示了酶的存在，这些酶类在保护细胞免受ROS的破坏作用方面起到作用，比如超氧化歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶，以及过氧化物酶。
几种不同的在糖酵解过程中也具有抗氧化活性，包括6PGDH，NADPH，HKI，包括在NADPH抗氧化剂产生过程中的GOTs，以及GOT1，这种物质被报道参与了抗氧化代谢过程，这些酶类阻止了ROS的过度产生，并阻碍了细胞死亡。
我们鉴别出几种急性期蛋白（APPs），这些蛋白为响应炎性反应改变了其在血清中的浓度，包括结合珠蛋白，血液结合素，2α-巨球蛋白，α-1-抗凝乳蛋白酶，α-1-抗胰蛋白酶以及血球蛋白相关的蛋白。我们并没有假设松果腺细胞本身分泌出这些因子，最有可能的情况是松果腺中的“肠道松果腺细胞”是这些因素的来源，但是，不论哪种类型的细胞可产生APPs，我们的数据指出松果腺的作用是响应炎症反应的急性期“分泌组”的来源。我们所检测的胃促胰酶以及组织蛋白酶G表明肥大细胞在炎症反应和宿主抵抗方面发挥了重要作用，并且被报道在松果体钙化增加的过程中表现出上升。
我们也鉴别出了几种伴侣蛋白，诸如在内质网中大量表达的蛋白质二硫异构酶（PDI）家族，以及热休克蛋白（HSPs），这种蛋白在应激发生过程中作为一种分子伴侣。
大多数PDIs具有氧化还原酶的活性和功能作为分子伴侣对于正确的蛋白质折叠通过催化蛋白质的形成、裂解以及二硫键在未折叠或者错误折叠的蛋白中的重新组合。例如，ERP29在处理ER内部的分泌蛋白中起到重要作用；PDIA3和PDIA6介导蛋白质的折叠并且作为一个分子伴侣阻止了蛋白质的聚合。在与CANX的互作过程中，同样人类松果腺中丰度较高的蛋白，调节了新合成的糖蛋白的折叠。
人类松果腺中HSPs中的主要成员包括HSPA1A，HSPA5，HSPA8，HSPA9，HSPB1，HSPD1，HSP90B1，HSP90AA1以及HSP90AB1。这些蛋白最可能在最初的多肽链合成过程中对应激反应提供保护，主要的方面是适当的蛋白质折叠方式以及消除错误折叠的蛋白。
除了PDI和HSPs，我们也检测除了抗氧化酶类中的一类过氧化物酶家族的成员（PRDX5和PRDX6），这两种蛋白在应答上升的ROS水平的过程中发挥了关键性作用，还有一类应答的分子伴侣蛋白，被称为CCT；包含分子伴侣的无尾复合物多态1（TCP1）包括CCT2，CCT3，CCT5，CCT7，CCT6A以及TCP1。这些蛋白辅助了邻近蛋白的折叠并需要ATP辅助其发挥作用。
有趣的是，几种蛋白包括在蛋白折叠和伴侣蛋白功能方面的蛋白在人类松果腺中表现出显著的昼夜节律，例如，HK1，GLO1，PDIA6，TF以及HSPB1在日间表现出上调，而PRDX5和PRDX6在夜间上调。这些结果表明人体的松果腺对抗氧化应激和蛋白质错误折叠方面具有抗氧化以及分子伴侣机制，一些生物通路中的成员可能表现出昼夜节律的调节，这可能对调控松果腺的动态平衡起到作用，而不同的抗氧化物在日间达到峰值，其他的激素，如褪黑激素，在夜间达到峰值。
3. 调节褪黑激素在人类松果腺中合成的蛋白
在松果腺中发现的最为重要的蛋白中，AANAT和ASMT（HIOMT）是两种在褪黑素合成通路上最后的两种酶。有趣的是无论在我们的研究中，还是最近发表的人体松果体蛋白组研究中，都没有发现与之对应的多肽片段。ASMT，从另一方面来讲以及ASMTL，一种AMST样蛋白，比ASMT具有较宽的表达谱，在两个研究中都被鉴别出来。不仅如此，色氨酸羟化酶1（TPH1）以及芳香化酶脱羧酶（AADC），催化从色氨酸到5-羟色胺重要反应步骤中的酶类也被检测到，因此，所有的来自色氨酸合成褪黑激素的必要组分在人类松果腺蛋白组数据库中被发现，除了AANAT。一个缺乏AANAT的可能的原因是其半衰期非常短，仅有8分钟（在啮齿类动物中），其稳定性通过苏氨酸31-磷酸化以及14-3-3结合而达到。但是，AANAT酶的活性以及褪黑激素的含量可通过生化方法进行度量，并且在人类中夜间会升高，到目前为止，对于此发现没有任何解释可以提供。除了对于一般生化过程广泛存在的蛋白之外，14-3-3蛋白被认为与AANAT是杂合二聚体因此对于其活性和稳定性都是必要的。在当前的人类蛋白组研究和以往发表的数据集中，对于14-3-3蛋白最常见的形式是在松果腺中。值得注意的是，我们之前发现ASMT酶活性在昼夜间不断循环。但在本篇文章中，ASMT蛋白的水平在昼夜间保持稳定，这表明这些酶活性的调节不是由不同的蛋白质水平造成的，最有可能是由其它转录后机制比如磷酸化或者二聚化造成的，有趣的是，该机制可能在患自闭症群体中调节失常。
除了需要合成褪黑激素的酶类之外，我们检测到很多褪黑激素合成中关键组分的存在。II型PKAα和β在松果体细胞中占主导的现象已经在牛和大鼠中得到证实。这里所提供的人类松果腺蛋白组数据证实了PKA调控II型亚基α和β在人类松果体切片中也占主导作用，这进一步受到AKAP亚型8样受体，9,10,11,12和13亚型所支持，转录后共激活因子如CRTC-1，CAP-1，CAP-2，β-抑制蛋白，光传感因子，光传感因子样蛋白以及光传感样因子蛋白-3，以及该通路上的其他组分。
与上述cAMP依赖的通路平行的通路中，松果腺中的肾上腺素受体可被PKC所激活，有丝分裂原蛋白激酶通路中很多具有差异的，之前描述的组分在这里被鉴别出来。最终，所有蛋白质磷酸化通路导致当前研究中磷酸化蛋白调节的蛋白质磷酸化酶受到调控，被称为PP-1a，包括转录因子CREB去磷酸化过程中苏氨酸-133磷酸化过程。
夜间松果腺合成褪黑激素的的机制获得了很好的记录，但是在日间，该机制阻止的褪黑激素的水平并未被描述。我们假设在日间来自副交感神经支配的乙酰胆碱（ACh）信号阻止了AANAT和终末褪黑激素产生的日间活性，也有证据表明cAMP-独立的谷氨酸盐对于褪黑激素产生的抑制效果。在日间，Ach激活褪黑激素细胞中烟碱养胆碱受体（nAChR）可导致细胞膜去极化，具有后续细胞间Ca2+增加的开放性电压门控的Ca2+通道（VGCC），能够最终的激发谷氨酸盐的释放引发自分泌谷氨酸盐信号。结合mGluR3可降低cAMP的水平导致AANAT活性和褪黑激素合成的下降，但是，大多数此类研究在啮齿动物中进行，因此该机制对松果腺褪黑激素合成的影响在人类中仍然有待确定。
本篇文章中，我们观察到AGRN是一种在人类松果腺中高度循环的蛋白，主要在日间出现。AGRN是一种硫化肝素蛋白多糖最初是由于其引发ACh受体（AChR）的聚合在神经肌肉连接处（NMJ）被发现，AGRN在各种基底组织中分泌包括松果腺或者神经元和神经胶质细胞膜上。正如在大鼠松果腺中所观察到的，我们也检测到了人类松果腺中的AGRN受体，以及松果腺中的Na+/K+-ATP酶离子泵（ATP1A3），但是却缺乏明显的节律调节特征。该受体在构建膜神经元静息电位的过程中发挥了关键性作用，AGRN阻止了ATP1A3离子泵的活性并导致了细胞膜的极化以及增加潜在的活性频率。
总之，基于我们的观察，我们能够推测出一个AGRN褪黑激素通路，主要在白天表达，和Ach一起与其受体ATP1A3互作，作为一种日间信号终结NE的夜间节律并且加快日夜转换的节律。考虑到该过程的复杂性以及各种参与其中的蛋白，我们不能确定哪种精确的机制发生以及哪种特定的通路包括在内。
4. 自闭症人体松果腺的作用
我们分析了7个自闭症患者的松果腺。自闭症在临床和遗传水平上是各种各样的，因此相对少量的人大体上排除了我们发现中任何的泛泛而论，然而，褪黑素的产生在大部分的患自闭症的病人中缺乏，常被报道有睡眠问题。我们之前报道了对照组中第10百分位数的阈值，大量的（74%）自闭症病人显示出下降的血小板ASMT活性，但是该机制仍然未知。我们的研究还显示出褪黑激素是具有高度遗传性的，但是与松果腺的大小无关联性。对于患者群体，我们可鉴别出恶性的ASMT突变功能上与ASMT活性和低褪黑素水平缺失有关，但是这些罕见的突变不能解释相对大比例个体的表现，本篇文章中，我们实验表明具有低ASMT活性的自闭症个体与对照组相比表现出相似的蛋白水平，其低水平的ASMT酶活性因此并非出现低水平ASMT蛋白的原因，但是在白天ASMT活性表现出生理学的下降（尽管ASMT蛋白长期以来保持稳定），因此我们假设白天在对照组中ASMT活性降低的机制在夜间病患中表现异常导致了褪黑激素的缺乏，而进一步的工作可鉴别出ASMT酶活性的调节可能会提供给我们一些在自闭症患者中褪黑激素缺乏的机制。
结论
我们的蛋白组分析主要目标是一些代谢酶类、抗氧化物、以及伴侣蛋白质分子富集在人类的松果腺中，其中一些蛋白质发挥了节律调节作用，表明与这些蛋白相关的松果腺中适应白天和夜间生理学功能蛋白的生物学功能。我们的研究同样也提供了自闭症患者松果腺蛋白组的特征，表明在病人群体中ASMT的缺乏通常是由缺乏ASMT蛋白所导致的，而我们进一步的工作是去了解ASMT活性在白天的下调在夜间异常活跃，并导致这类人群中严重的褪黑激素缺乏的原因。较大的样本含量也提供了年龄对于睡眠的影响以及对于死亡和蛋白组潜在影响的清晰图景，而一个对于蛋白质伴侣的分析以及潜在的转录后修饰的分析可能也对理解人类松果腺提供了重要的线索。