科研│J AGR FOOD CHEM（一区）代谢物和转录组综合分析了红皮龙眼果皮着色机理（国人佳作）
编译：伊一，编辑：景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
龙眼（ Dimocarpus longan Lour.）果皮富含次生代谢产物，外观通常为黄褐色或灰黄色。在这里，研究者获得了一种特殊的龙眼品种—红色果皮(RP)龙眼 ，它有一个强烈的红色果皮。为了解RP龙眼的着色机理，研究利用代谢组学和转录组学数据分析了其次生代谢产物和分子机理。液相色谱-串联质谱结果表明，RP龙眼和'石硖’(SX)龙眼中共鉴定出597种物质。在这些物质中，SX龙眼鉴定出33种物质(主要包括黄酮类物质)和23种物质(主要含酚酸类物质)。研究者鉴定了龙眼果皮中的五种花青素，包括三种矢车菊素衍生物、一种翠雀花素衍生物和一种天竺葵素衍生物。花青素的主要成分为三种矢车菊素衍生物：矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-6″-丙二酰葡萄糖苷和矢车菊素0-丁香酸，它们只存在于RP龙眼中。飞燕草素3-O-葡萄糖苷只存在于SX龙眼中，而天竺葵素O-芸香苷在RP和SX龙眼都存在。然而，它们的含量极低。RP龙眼花色素苷生物合成途径中的结构基因F3H、F3′H、UFGT和GST以及控制基因MYB、bHLH、NAC和MADS显著上调。综上所述，RP龙眼的强红色是由于果皮中积累了矢车菊素衍生物，基因F3′H和F3′5′H可能在选择合成哪种花色苷成分中起重要作用。这些结果可为理解和开发龙眼果实中的生物活性物质提供科学指导。
论文ID
原名：Integrative Analysis of the Coloring Mechanism of Red Longan Pericarp through Metabolome and Transcriptome Analyses
译名：代谢物和转录组综合分析了红皮龙眼果皮着色机理
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：4.192
发表时间：2020年12月
通讯作者：石胜友，魏永赞
通讯作者单位：广东湛江中国热带农业科学院南亚热带作物研究所热带水果生物学农业部重点实验室
DOI号：10.1021/acs.jafc.0c05023
实验设计
结果
1 龙眼果实的外观特征
一般来说，大多数龙眼品种的果皮为黄褐色或灰黄色，RP龙眼极其罕见，从未有过报道。SX龙眼是最常见的品种之一，也是中熟较早的品种之一；它的果皮是黄褐色的，它的假种皮是浅透明的黄色（图1A）。比SX龙眼更有趣的是，RP龙眼的果皮外面是深红色的，里面是粉红色的(图1B)。然而，RP龙眼的假种皮与普通龙眼相似，由于缺乏色素积累而呈现乳白色(图1B)。
图1.不同品种龙眼的形态观察:(A)黄褐色果皮品种'石硖’和(B)红色果皮品种'红色果皮龙眼’。
2 花青素成分和含量的HPLC (高效液相色谱)分析
为了初步探索果皮花青素的种类，研究采用高效液相色谱法检测了龙眼不同组织中6种花色苷的含量(图2A)。高效液相色谱和代谢组学分析表明，RP龙眼果皮富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷。然而，由于含量极低，在两个龙眼品种(图2B)的果皮中既没有检测到天竺葵素0-芸香苷，也没有检测到飞燕草素3-0-葡萄糖苷。同时，还检测了龙眼和SX龙眼其他组织中花色苷的含量和成分。结果表明，RPP、龙眼核、龙眼核1、龙眼核2、龙眼核3和龙眼核2中均含有矢车菊素3O-葡萄糖苷。相比之下，在SX龙眼的所有测试组织中没有检测到花青素。在RP龙眼中，果皮含有3.08毫克/克鲜重的矢车菊素3-O-葡萄糖苷，高于其他组织(图2C)。
图3.代谢物质量和差异代谢物表达分析：(A)OPLS-DA，(B)差异代谢物的数量和上调/下调的表达，(C)上调代谢物的类型和数量，(D)下调代谢物的类型和数量。
3 代谢组数据质量分析
主成分分析图显示了两个不同品种中代谢物的明显分离。果皮中的两个主成分PC1和PC2分别占78.3%和6.2%。PC1值越大，意味着不同品种间的遗传变异程度越高。主成分分析结果显示两个品种间存在显著差异。OPLS-达结果(图3A)显示Q2Y的值为1，表明代谢组学数据的可靠性。
4 两个龙眼品种代谢产物的比较
通过液相色谱-串联质谱法鉴定了两个龙眼品种果皮中的597种代谢物。最丰富的代谢物是类黄酮，其次是酚酸、氨基酸及其衍生物、其他物质和脂类。总共有33种代谢产物只存在于龙眼中(补充资料表S2)；在SX龙眼中特异性检测到23种代谢产物(支持信息补充表S3)；在两个品种中都发现了541种代谢产物。
在这些黄酮类化合物中，鉴定出五种花青素，包括三种矢车菊素衍生物、一种翠雀花素衍生物和一种天竺葵素衍生物。花青素来源于矢车菊，其中含有矢车菊素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)、矢车菊素3-O-葡萄糖苷和矢车菊素O-丁香酸，仅在RP龙眼中存在，其含量明显高于衍生物翠雀素和天竺葵素。飞燕草素3-O-葡萄糖苷是一种飞燕草素衍生物，只存在于SX龙眼中。相反，在两个品种中都检测到了来源于天竺葵素的天竺葵素-芸香苷。
5 差异代谢物筛选及KEGG注释
根据t检验P < 0.05和VIP值≥1筛选了差异代谢物。结果显示了一个火山形状的情况(图3B)。在两个品种的果皮中获得了110种不同的代谢产物。与SX龙眼相比，龙眼果皮中70种代谢产物增加，40种代谢产物减少。从70种上调的代谢产物中鉴定出2种花青素，包括矢车菊素3-O-葡萄糖苷和矢车菊素0-丁香酸，且仅在龙眼中发现。黄酮醇在上调代谢产物中所占比例最大，其次是黄酮和氨基酸及其衍生物(图3C)。
同时，前三个下调的代谢物是氨基酸及其衍生物、有机酸和酚酸(图3D)。值得注意的是，黄酮和黄酮醇在RP龙眼中上调。KEGG富集分析的结果显示氨酰基-tRNA生物合成(11种代谢物，ko00970)、ABC转运蛋白(15种代谢物，ko02010)和次级代谢物生物合成(21种代谢物，ko01110)是显著的(支持信息的补充图S3)。
6 转录组测序和注释
根据基础成分分析，每个样品的鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量超过46%，过滤后每个样品的净读数为3.84-4.78 GB(支持信息的补充表S4)。将所有干净的读数与龙眼参比基因组进行比较。SX(75.45-84.31%)和RP(86.56-86.85%)龙眼的大部分序列与参考基因组匹配(支持信息补充图S4)。这些结果保证了数据的可靠性。在使用Stringtie软件重建转录本后，在测序结果中发现但未包含在参考基因组(或参考基因集)中的单基因被定义为新基因。通过比较鉴定出2090个新基因。在这些基因中，1743-1784存在于SX龙眼中，占新基因的83.4-85.36%，1458-1489存在于RP龙眼中，占新基因的69.76-71.24%(补充资料表S2)。
使用BLASTX (E值< 10-5)根据公共数据库GO、Swiss-Prot、NCBI-NR和KEGG对所有组装的基因进行注释。差分遗传聚类分析主要集中在三个方面:细胞成分、生物过程和分子功能。共有580个单基因参与了生物过程中的代谢过程，1449个单基因在分子功能上具有催化活性(支持信息补充图S5)。
在这两个品种中，共有2538个基因被注释为129个KEGG代谢途径。其中，885个单基因参与了代谢途径，占34.87%。研究者获得了22条显著富集的代谢途径，q值< 0.05。这些途径是植物-病原体相互作用、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径-植物、类苯丙酸生物合成、类黄酮生物合成以及淀粉和蔗糖代谢。此外，类黄酮生物合成[ko00941，71差异表达基因(DEGs)]和类黄酮和黄酮醇生物合成(ko00944，16 DEGs)显著增强(支持信息补充图S6)。
基于小于0.05的FDR和大于1的|log2FC|从转录组数据中共鉴定出7352个差异基因。在这些基因中，3331个上调，4021个下调。
图4. 龙眼果实花青素生物合成途径中相关结构基因的表达水平。 热图表示两个龙眼品种相应结构基因的表达，热图中从蓝色到红色表示结构基因的表达水平从低到高。 该途径中的酶如下：PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，肉桂酸4-羟化酶；4CL，4-香豆酸：CoA连接酶；CHS，查尔酮合成酶；CHI，查尔酮异构酶；F3H，黄烷酮3-羟化酶；F3'H，黄酮3’-羟化酶；F3'5’H，黄酮3'5’，5’-羟化酶；DFR，二氢黄酮醇4-还原酶；ANS，花青素合成酶；UFGT，UDP-葡萄糖3-葡萄糖基转移酶；3GT，UDP-葡萄糖：花青素3-葡萄糖基转移酶；GST，谷胱甘肽S-转移酶。
7 花青素生物合成相关结构基因的分析
在已报道的花色素生物合成途径的基础上，研究者构建了包括龙眼果皮花色素生物合成途径中各结构基因表达热图的途径图(图4)。PAL、C4H、4CL、CHS和CHI等结构基因参与了花青素生物合成过程中的早期酶促反应。研究者发现早期结构基因含有PAL基因(Dlo_006555.1和Dlo_011085.1)，C4H基因(Dlo_030106.1和Dlo_033790.1)，4CLgenes (Dlo_014946.1和Dlo_016324.1)，CHS基因(Dlo_014741.1)，CHI基因(Dlo_010909.1)上调相比之下，RP龙眼中有3个C4H基因(Dlo_031917.1、dlo_037624.1和dlo_034737.1)、1个4CL基因(Dlo_023263.1)和1个CHS基因(Dlo_003187.1)下调(图4)。
F3Hgene可以催化柚皮素合成二氢山奈酚，这一过程是不同类型花青素生物合成的重要前体和关键分支。从转录组数据中鉴定出两个F3H基因在RP龙眼中高表达(Dlo_018657.1和Dlo_032762.1)，一个仅在RP中表达(Dlo_018657.1)(图4)。F3′H和类黄酮3′5′羟化酶(F3′5′H)基因的表达水平决定了花青素的合成成分。31此外，研究者发现一个F3′H基因(Dlo_031828.2)在RP龙眼中上调，两个F3′5′Hgenes(Dlo _ 005519.1和Dlo_005520.1)在SX龙眼中上调(图4)。因此，F3′H和F3′5′H的差异表达可能是直接决定合成哪种花色苷的关键因素。
DFR是花青素生物合成中的关键酶，对各种底物具有不同的催化能力。这里，鉴定了在SX龙眼中高表达的两个DFR基因(Dlo_025847.1和Dlo_024800.1)和在RP龙眼中高表达的一个ANS基因(Dlo_005587.1)（图4）
UFGT和3GT是花青素生物合成的后期关键酶，能催化不稳定的花青苷生成花青素。8个UFGT/3GT基因上调(Dlo_005874.1，Dlo_027263.1，Dlo_007742.1，dlo_036028.1，Dlo_007739.1，Dlo_010986.1，Dlo_010983.1，Dlo_007738.1)，3个UFGT/3GT基因下调(Dlo _ 023)谷胱甘肽转移酶保护类黄酮不被氧化和/或引导它们进入液泡。RP龙眼中6个GST基因(Dlo_019180.1，Dlo_027220.1，Dlo_029487.2，Dlo_017720.1，Dlo_027225.1，Dlo_027221.1)上调，只有1个GST基因(Dlo_027215.1)下调(图4)。
图5. 与花青素生物合成有关的转录因子分析。(A)MYB转录因子的系统发育树；(B)bHLH转录因子的系统发育树；(C)MYB、bHLH和WD40的表达热图；(D)NAC、MADS、ERF、WRKY和bZIP的表达热图。
8 花青素生物合成相关转录因子的鉴定
花青素的生物合成主要由MBW蛋白复合体和其他转录因子调节。研究者发现MYB、ERF、NAC和bHLH是与龙眼花色素苷生物合成相关的前四个转录因子(支持信息补充图S7)。在上调候选基因和报道的与其他植物中花青素生物合成相关的基因之间构建了MYB和bHLH转录因子的各自的系统发育树(图5的图板A和B)，包含MYB、bHLH和WD40的MBW复合物是关键的调节因子，直接调节花青素生物合成中的下游结构基因。研究者在龙眼果皮中获得了43个MYB、23个bHLH和3个WD40(图5C)。从候选基因的系统发育分析和转录水平来看，6个MYB和4个bHLH仅在RP龙眼中表达，它们可能参与龙眼花色素生物合成的调控。根据以前的报告，其他转录因子 NAC， MADS，ERF， WRKY和bZIP也从差异表达基因中获得(图5D)。这些转录因子也可能影响或参与花色素生物合成中结构和调节基因的调节。
图6. 与花青素生物合成途径相关的结构基因和转录因子的表达分析。(A)龙眼两个不同品种花青素生物合成过程中关键结构基因和转录因子的表达水平分析；(B)基于RNA-Seq和qRT-PCR数据的相关分析。
9 基因表达qRT-PCR分析
为了进一步证实RNA-Seq结果，研究者对参与花青素生物合成途径的11个结构基因和7个调控基因进行了qRT-PCR分析。结果表明，这些基因中有17个在SX龙眼中高表达，但只有F3’5’H基因在RP龙眼中高表达(图6A)。相关分析进一步显示了RNA-Seq和qRT-PCR之间的显著相关性(相关系数为0.78)(图6B)。这些结果表明，转录组数据与龙眼果皮花色苷生物合成相关基因的表达准确对应。
讨论
龙眼果皮含有大量的功能物质和生物活性化合物，如酚类、多糖、生物碱、6-原花青素A2和表儿茶素，这些化合物表现出许多优异的生理活性，包括抗氧化、抗酪氨酸酶、免疫调节、抗癌、抗炎和抗真菌作用。因此，研究和利用龙眼果皮中的生物活性物质对开发新药和天然保健品具有重要意义。通过果皮代谢组学分析，研究者鉴定了两个龙眼品种的597种代谢产物。在二级分类中，这些代谢物被分为21种物质(图3中的C和D图)。其中，RP龙眼果皮中黄酮和黄酮醇含量显著增加。这些信息为龙眼功能性物质的研究和开发提供了新的见解和科学依据。
花青素是决定果实颜色的关键色素，它们通过类黄酮途径合成，促进人类健康，保护植物免受环境胁迫。然而，没有研究或报告关注龙眼果实中的花青素。高效液相色谱结果显示，RP龙眼中矢车菊素3-O-葡萄糖苷的含量为3.08毫克/克果糖，但飞燕草素和天竺葵素由于含量低而未被检测到(图2B)。利用龙眼果皮的代谢组学数据，研究者鉴定了5种花色素。在这些花色素苷中，含有矢车菊素O-丁香酸、矢车菊素3O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)和矢车菊素3-O-葡萄糖苷的矢车菊素衍生物只存在于RP龙眼中。其含量明显高于飞燕草素和天竺葵素衍生物。作为翠雀花素衍生物，翠雀花素3-O-葡萄糖苷只存在于SX龙眼中，含量极低。RP和SX龙眼中仅存在由天竺葵苷衍生而来的天竺葵苷O-芸香苷，但其含量也过低。因此，龙眼的红色是由于果皮中富含矢车菊素衍生物。花色苷在各种水果或植物中的成分、含量和分布存在相当大的差异。荔枝(荔枝)也属于无患子科。果皮中主要花色苷成分为矢车菊素3-葡萄糖苷(92%)和天竺葵素3-葡萄糖苷(8%)。据报道，矢车菊素3-半乳糖苷是苹果和红梨果实中的主要成分。同时，影响葡萄果皮颜色的主要花色苷是牡丹苷衍生物和锦葵苷3-O-葡萄糖苷。因此，花色苷成分在同一科的植物中存在某些相似性。
先前的研究已经证明花青素生物合成涉及由早期生物合成基因(CHS、CHI和F3H)和花青素特异性生物合成基因(F3’H、F3’5’H、DFR、ANS和UFGT)编码的多种酶。在本研究中，RP龙眼中PAL、F3H、F3’H、ANS、UFGT和GST的表达水平显著高于SX龙眼，而F3’5’H和DFR龙眼的转录水平低于SX龙眼(图4)。二氢山奈酚是不同类型花色苷生物合成的重要前体和关键分支。DFR酶可以选择性催化三种不同类型的底物合成三种特定的产物:无色飞燕草素、无色天竺葵素和无色矢车菊素。研究者发现RP龙眼的花青素含量明显高于SX龙眼，而飞燕草素仅在后者中检测到。因此，推测DFR在SX龙眼中的高表达可能与翠雀花素的积累有关。有报道证明，DFR不能有效地减少葡萄风信子中的二氢山奈酚。)，其表达与翠雀宁密切相关。
F3′H的高表达通过DFR和UFGT两个酶促反应促进了二氢槲皮素的合成，进而在RP龙眼中形成矢车菊素3-O-葡萄糖苷。相反，SX龙眼果皮中F3’5’H的高转录水平增强了翠雀花素3-O-葡萄糖苷(图4)。F3′H和F3′5′H基因的表达决定了花青素合成的组分，这与玫瑰和葡萄花青素生物合成的结果一致。谷胱甘肽硫转移酶是水果和叶子中的花青素转运体，研究者在转录数据中鉴定了7个谷胱甘肽硫转移酶基因。与SX龙眼相比，这些基因中的6个在RP龙眼中显著增加(图4)。
早期生物合成基因受三个冗余R2R3MYB TFs调控；同时，花色素特异性生物合成基因受MYB bHLH-WD40蛋白复合物调控。在龙眼中，研究者根据它们的表达水平和系统发育分析鉴定了6个MYB和4个bHLH。据报道，MYB转录因子参与荔枝、苹果和葡萄中花青素的生物合成和积累的调控。此外，bHLH与MYB和WD40相互作用，共同调节花青素的生物合成。从报道的结果中，研究者还获得了1个NAC、2个MADS和1个ERF，它们在龙眼中特异表达。这些转录因子已被证明通过与MYB启动子结合或通过模式植物和其他水果中的蛋白质-蛋白质相互作用直接或间接调节花青素的生物合成。这些发现有助于阐明龙眼花色素苷生物合成的分子机制和调控网络，为培育龙眼新品种提供生物学依据。
更多推荐
1 科研│J AGR FOOD CHEM（一区）：代谢物和转录图谱分析揭示了“紫娟”茶树花青素代谢的分子机制（国人佳作）
END