科研 | 川北医学院附属医院：lncRNA NEAT1充当ceRNA阻止神经细胞凋亡以减轻新生缺血性脑损伤（国人佳作）
编译：思越，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：lncRNA NEAT1 Binds to MiR-339-5p to Increase HOXA1 and Alleviate Ischemic Brain Damage in Neonatal Mice
译名：lncRNA NEAT1与MiR-339-5p结合增加HOXA1含量并减轻新生小鼠的缺血性脑损伤
期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids
IF：5.919
发表时间：2020年6月5日
通讯作者：赵婧
通讯作者单位：川北医学院附属医院
DOI号：10.1016/j.omtn.2020.01.009
实验方法
作者先通过构建HIBD细胞模型，观察在疾病进展中，miR-339-5p对细胞凋亡的影响。并在数据库starBase中分析了lncRNA NEAT1，HOXA1和miR-339-5p之间的相互作用，并使用双荧光素酶报告基因检测进一步验证，并从mRNA和蛋白角度观察了以上指标以及凋亡相关蛋白的变化。最后构建小鼠HIBD模型，在体外实验中验证lncRNA NEAT1下调miR-339-5p以增加HOXA1的表达，进而减轻HIBD进程。
结果
1.在HIBD小鼠和细胞模型中，均表现出miR-339-5p的表达降低
作者首先研究了miR-339-5p在HIBD中的表达情况。通过构建HIBD小鼠模型，并通过以下方面测试，HE染色显示与假手术小鼠相比，HIBD小鼠具有明显的脑损伤（图1A），并通过TUNEL染色显示出HIBD小鼠细胞凋亡明显增加（图1B）。莫里斯水迷宫测试中，HIBD小鼠的逃脱潜伏期及到达平台所消耗的时间均长于假手术小鼠（图1C、D），提示HIBD造模成功。
通过qRT-PCR实验检测miR-339-5p在小鼠脑组织中的表达，发现与假手术小鼠相比，HIBD小鼠的脑组织中miR-339-5p的表达更低（图1E），暴露于氧-葡萄糖剥夺（OGD）后，神经元细胞中miR-339-5p的表达下降（图1G）。
图1 HIBD的小鼠和细胞模型。（A）H＆E染色的脑组织的形态变化；（B）TUNEL染色测量海马细胞凋亡状态；（C）莫里斯水迷宫的逃生潜伏期；（D）莫里斯水迷宫小鼠到达平台消耗时间；（E）qRT-PCR检测miR-339-5p在小鼠脑组织中的表达；（F）免疫荧光检测海马神经元细胞的NF-200表达；（G）氧糖剥夺（OGD）后海马神经元细胞中miR-339-5p的表达；
2.miR-339-5p过表达抑制神经元细胞活力并促进细胞凋亡
接着，作者对OGD期间miR-339-5p的过量表达对神经元细胞活力和凋亡的影响进行研究。结果表明，过表达的miR-339-5p抑制了OGD诱导的神经元细胞活力（图2A），增强了缺氧缺血诱导的神经元细胞凋亡（图2B），并观察到Bax和caspase-3的表达升高，以及Bcl-2的表达降低（图2C）。
图2缺氧缺血后降低的miR-339-5p抑制了神经元细胞活力和细胞凋亡。（A）CCK-8分析神经元细胞活力；（B）TUNEL染色测定神经细胞凋亡（C）凋亡相关蛋白表达的Western-blot验证
3.抑制miR-339-5p使HOXA1表达上调并减少神经元细胞凋亡
作者通过分析starBase数据库以及GSE37777提供的数据，表明miR-339-5p可能与HOXA1结合（图3A）。此外，与对照相比，HOXA1 mRNA（图3B）和蛋白质（图3C）表达在OGD处理的细胞中表现出升高的水平。通过双荧光素酶报告基因分析，以确定miR-339-5p与HOXA1的结合关系。结果表明，HOXA1野生株可与miR-339-5P结合，但在HOXA1突变株中不可结合（图3D）。此外，过表达miR-339-5p的情况下，神经元细胞中HOXA1 mRNA（图3E）和蛋白质（图3F）的表达降低。表明miR-339-5p可以结合并减少HOXA1的表达。接着，作者确定了miR-339-5p和HOXA1对神经元细胞凋亡的影响。当在OGD期间过表达miR-339-5p时，凋亡神经元细胞数量增加，以及凋亡相关蛋白Bax和caspase-3升高和Bcl-2降低（图3H）；而当过表达miR-339-5p和HOXA1时，减轻神经元细胞凋亡（图3G）和凋亡相关蛋白的表达（图3H），说明HOXA1过表达逆转了OGD期间miR-339-5p的促凋亡作用。
图3 miR-339-5p和HOXA1的结合对缺血缺氧神经元细胞凋亡的影响。（A）starBase数据库预测miR-339-5p与HOXA1之间的结合位点；（B）HOXA1 mRNA表达量；（C）HOXA1 蛋白表达量；（D）通过双荧光素酶报告基因分析miR-339-5p与HOXA1的结合；（E）miR-339-5p过表达时，HOXA1 mRNA表达升高；（F）miR-339-5p过表达时HOXA1的蛋白表达。；（G）TUNEL染色评估神经元细胞凋亡；（H）Western-blot验证神经细胞凋亡相关蛋白的表达
4.lncRNA NEAT1过表达抑制了miR-339-5p的表达，从而抑制神经元细胞凋亡
假设HIBD中miR-339-5p的表达受上游lncRNA调控。因此，作者通过starBase数据库预测与miR-339-5p结合的潜在lncRNA。据预测，lncRNA NEAT1与miR-339-5p之间存在互补片段（图4A），并通过PCR验证出OGD期间lncRNA NEAT1升高（p <0.05；图4B），与lncRNA NEAT1调节miR-339-5p表达的假设相符。通过双荧光素酶报告基因分析，以确定lncRNA NEAT1与miR-339-5p的结合关系。结果表明，NEAT1野生株可与miR-339-5P结合，但在NEAT1突变株中不可结合。接下来，发现lncRNA NEAT1的过表达减少了miR-339-5p的表达，从而提高了神经元细胞中HOXA1 mRNA（图4D）和蛋白质（图4E）的表达，说明过表达lncRNA NEAT1减少了miR-339-5p表达并使HOXA1上调。此外，在OGD模型中通过敲低lncRNA NEAT1（图4F），发现神经元细胞凋亡增多（图4G），以及凋亡相关蛋白Bax和caspase-3升高和Bcl-2降低（图4H），随后通过抑制miR-339-5p减轻神经元细胞凋亡（图4G）和凋亡相关蛋白的表达（图4H）。说明lncRNA NEAT1通过结合并下调miR-339-5p，减少了缺血缺氧期间神经元细胞的凋亡。
图4.缺血缺氧期间，lncRNA NEAT1过表达下调miR-339-5p抑制缺氧缺血性神经细胞凋亡（A）starBase数据库预测lncRNA NEAT1与miR-339-5p之间的结合位点；（B）qRT-PCR检测HOXA1在神经元细胞中的表达；（C）双荧光素酶报告基因测定，miR-339-5p与lncRNA NEAT1之间的结合；（D）qRT-PCR检测miR-339-5p和HOXA1在神经元细胞中的表达；（E）Western-blot检测HOXA1在神经元细胞中的蛋白表达；（F）氧糖剥夺神经细胞相对于lncRNA NEAT1敲低的神经细胞中NEAT1的表达量；（G）TUNEL染色检测OGD处理的神经元细胞的凋亡；（H）神经细胞凋亡相关蛋白的表达
5.lncRNA NEAT1下调miR-339-5p以增加HOXA1的表达进而减轻HIBD进程
作者通过体外实验，研究了lncRNA NEAT1 / miR-339-5p调控机制对HIBD进程中的作用。分别使用sh-NEAT1和miR-339-5p-antagomir处理新生的HIBD小鼠，抑制lncRNA NEAT1和miR-339-5p。在莫里斯水迷宫测试中，与对照组相比，sh-NEAT1逃脱潜伏期及到达平台所消耗时间均显著增加（图5A、5B），sh-NEAT1&miR-339-5p-antagomir组小鼠恢复了与对照组相近的潜伏期和消耗时间。结果表明lncRNA NEAT1可以增强新生HIBD小鼠的学习和记忆能力。
收集HIBD小鼠的海马组织，通过HE染色来观察形态变化。发现用sh-NEAT1处理抑制lncRNA NEAT1加重脑损伤，神经元细胞的凋亡数量增加（图5C、5D），而抑制miR-339-5p可减轻脑损伤，并使神经元细胞的凋亡正常化（图5C、5D）。在HOXA1的研究中，抑制lncRNA NEAT1处理后，HOXA1 mRNA下调，但在抑制miR-339-5p后，HOXA1 mRNA正常化（p <0.05；图5E）。免疫组织化学结果表明，HOXA1蛋白表达获得了相似的结果（图5F）。以上结果表明，在体外实验中，lncRNA NEAT1结合miR-339-5p以上调HOXA1并抑制HIBD的发育。
图5. lncRNA NEAT1和miR-339-5p抑制作用对HOXA1表达和新生HIBD小鼠的影响（A）莫里斯水迷宫的逃脱潜伏期；（B）莫里斯水迷宫小鼠到达平台消耗时间；（C）H＆E染色后海马组织的形态变化；（D）TUNEL法测定神经细胞凋亡；（E）qRT-PCR检测HOXA1在海马组织中的mRNA表达；（F）免疫组化法测定海马组织中HOXA1蛋白的表达；
结论
细胞凋亡被证明是新生儿HIBD的重要诱因。本文通过构建动物HIBD模型和细胞OGD模型，探索lncRNA NEAT1 / miR-339-5p / HOXA1在HIBD进程中的作用，为了解HIBD中miR的神经元凋亡途径提供新的见解。通过细胞和动物研究发现，lncRNA NEAT1通过充当ceRNA的作用，阻碍miR-339-5p与HOXA1的结合，进而增加HOXA1的表达，阻止神经元细胞凋亡（图6）。这种作用可能成为潜在的新型治疗靶标，值得进一步研究。
图6 lncRNA NEAT1 / miR-339-5 / HOXA1参与HIBD调控的潜在机制示意图，lncRNA NEAT1结合miR-339-5p，减少了miR-339-5p对HOXA1的抑制作用，并减少了新生HIBD小鼠神经元细胞凋亡。
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