揭示：为什么你做的RT-PCR实验总是失败？
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RT-PCR是Reverse Transcription PCR的简称，中文名为逆转录聚合酶链反应，这是一种将RNA经过反转录酶的作用下合成cDNA，再将cDNA作为模板，扩增合成目的片段的分子生物学技术。这种技术灵敏用途广泛，不仅可以快速检测基因表达差异，还可以不必构建cDNA文库，克隆cDNA，而且RT-PCR作为模板的RNA种类不是那么严格，可以是总RNA，或者是mRNA，也可以是体外转录的RNA产物，是一项处理RNA常用到的经典分子生物学技术。
RT-PCR总的技术路线是：RNA提取——引物设计——RT-PCR-——电泳，这四个部分构成了我们的整个RT-PCR实验，实验难度不是很高，但是注意事项很多，一不小心，就会失败，这样既浪费RNA和试剂耗材，也浪费了时间，那么怎么才能做好RT-PCR呢？下面“好戏登场”了，请小伙伴们拿起笔和笔记本，我们一起学习一遍这项让人“又爱又恨”的PCR技术吧。
一、 RNA提取
在RT-PCR实验中，RNA是当之无愧的主角，是作为模板的存在，要想确保RT-PCR成功，关键一点是确保模板RNA无RNA酶和基因组DNA的污染，因此提取出高质量的RNA是实验成败的关键因素，那么如何才能提取出高质量的RNA呢，重要的一点就是尽力杜绝RNA的内外源性污染，具体方法可以回顾本号前几天的文章《如何提取出高质量的RNA，一文带你“扫雷”》，链接地址：https://mp.weixin.qq.com/s/zouXWqGnoyHWdGu7pAEkpQ，学习更加详细的方法。
二、 引物设计
用于反转录的引物，可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT、特异性引物中的一种，此外对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种引物都可以。在设计特异性引物的时候我们根据目的基因的保守区域设计引物，交由公司合成，在设计引物过程中，我们还需要遵循引物设计原则:
1、 扩增产物长度在75-200bp
2、 引物长度在15-25碱基之间
3、 G+C含量在50%-60%之间，上下游引物Tm 值不能超过2℃的差异
4、 避免3个G或者C碱基的重复
5、 避免二级结构形成引物之间避免出现3个碱基以上的互补，避免出现引物二聚体
6、 避开内含子，以免基因组DNA污染
7、 最后用BLAST验证引物特异性
三、 RT-PCR
该实验有两种方法进行：一步法和两步法，在一步法中，RT-PCR中逆转录和PCR在为它们优化的条件下，在一只管中顺次进行；两步法中RT-PCR下中每一步都在最佳条件下进行cDNA的合成，首先在逆转循环缓冲液中进行，取出1/10的反应产物进行PCR。
首先介绍的是一步法，一步法的优点是在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖和吸取转移样品，方便处理大量样品，有助于减少残余污染。
设备及材料:PCR仪、电泳仪、RNA、一步法试剂盒（天根、TAKALA等等）、无RNase枪头、移液器、镊子、冰浴箱、超净台、EP管
步骤：
1、 将RNA、引物、试剂盒试剂短暂离心混匀后放在冰浴上保持低温，否则会发生降解失效。
2、 体系配置和PCR条件设定按照试剂盒说明书添加即可跑程序。
其次介绍的是两步法，两步法优点是反转录和PCR 扩增分两步进行，首先从 RNA 模板反转录得到 cDNA，得到的 cDNA 再进行一次或多次不同的 PCR 反应，可以从一个特定的样品中反转录出所有的 mRNA 的信息，减少人为误差，在聚合酶和引物的选择上更加灵活。
设备及材料:PCR仪、电泳仪、RNA、两步法试剂盒（天根、TAKALA等等）、无RNase枪头、移液器、镊子、冰浴箱、超净台、EP管
步骤：
1、 第一步：逆转录反应
2、 第二步：PCR反应
两个步骤都按照两步法试剂盒说明书添加体系即可跑PCR程序。
注意事项：
1、 实验材料准备：准备好无RNase的枪头和EP管等，实验前用灭菌过的镊子将枪头和EP管插好，等待使用，如果是普通枪头和EP管需要用0.1%的DEPC水浸泡一晚，然后高温湿热灭菌，取出来后烘干水分等待使用。
2、 反应体系计算：反应体系应该根据实验用量多配置两管，避免液体沾到枪头上导致样品含量不够，
3、 实验人员应该全程佩戴口罩和手套，减少人员流动。
4、 实验过程中的加样应该在超净台中进行减少污染风险。
5、 加样过程中，要注意不同试剂需要更换枪头
6、 所有试剂都应该在冰浴上融化，等待完全融化后在吸取试剂。
7、 设置阳阴性对照
四、 电泳
材料：琼脂糖、EB、1xTAE溶液、loading buff、2000Marker、PCR产物
1、配胶:
8孔小胶 TAE 20ml、琼脂糖 0.30g
25孔中胶 TAE 40ml、琼脂糖 0.6g
操作步骤：
1、将电泳槽清洗干净并晾干，插好梳子。
1、称取琼脂糖放入配胶专用烧瓶倒入相应的1×TAE含量。
2、将烧瓶加热煮沸。
3、将沸腾的液体中加入EB一般小胶2ul，中胶6ul。
4、倒入电泳槽，倒入时缓慢倒入防止产生气泡，待30分钟左右琼脂糖凝胶凝固后拔出梳子进行跑胶。
2、跑胶:
（1）电泳槽加入1×TAE,电泳缓冲液，将琼脂糖凝胶放入电泳槽，缓冲液没过胶。
（2）将5ul PCR产物和1ul 6x loading buff混匀加入胶板单格，加入3ul Marker
（3）接通电源，100v跑胶。(跑胶方向是从负极到正极）,当条带跑到2/3时停止跑胶，带手套取胶放在紫外凝胶成像仪观察。
3、条带观察：
观察原则：
1、 是否有扩增产物，如上图出现了明显的条带，表明有扩增产物。
2、 观察是否有拖尾或者区带，如有则说明有非特异性产物扩增，如上图只有单一条带，则表明扩增成功。
3、 分子量标准区带是否分开，如上图Marker区带分开明显。
4、 与分子量标准比较，PCR产物长度是否正确，如上图产物长度在400bp左右，产物长度需要与自己先前的目的基因长度相互印证。
5、 是否出现引物二聚体，如有条带模糊不整齐一致，条带宽等现象，可能是引物二聚体，如上图条带单一整齐一致 则表明没有引物二聚体。
6、 如果出现引物二聚体，解决方法是（1）重新设计引物，这是最根本的方法（2）cDNA出现污染问题，通常出现在两步法中（3）模板浓度小，适当增加模板浓度（4）适当提高退火温度，摸索退火条件。
RT-PCR技术应用广泛，在实验中应该多注意总结出现的问题，争取不出现差错，那么就会顺利的做成RT-PCR实验。
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