用世界最快的5分钟检测新型冠状病毒的理研和东大、京大开发了新检测技术

用世界最快的5分钟检测新型冠状病毒的理研和东大、京大开发了新检测技术

理化学研究所(理研)、东京大学、京都大学的研究小组19日发表了开发出世界最快5分钟以内检测新型冠状病毒的技术。 这是一种既能实现传统抗原检查“迅速简便”又能实现核酸检测“高灵敏度”的新诊断方法，可以在短时间内诊断大量标本。 据说与企业合作以2年左右的实用化为目标。 新型冠状病毒肺炎的诊断目前正在实施检测病毒抗原的抗原检测和放大病毒RNA进行检测的核酸检测，分别用于筛选和确诊等。 抗原检查只需要30分钟左右就可以简便地检测出病毒，所以适合筛选，但是检测灵敏度不高，检测错误也多是个课题。 核酸检测在检测的预处理过程中最短也需要1个小时左右，还会发生检测错误，因此很难在短时间内、高精度地诊断大量的检测体。

以往的新型冠状病毒肺炎诊断法的概念图(由理研东大京大的研究小组提供)

因此，研究小组的理研开拓研究总部主任研究员渡边力也、东京大学尖端科学技术研究中心教授西增弘志、京都大学病毒再生医科学研究所教授野田岳志等人根据将世界最先进的“微芯片技术”和核酸检测技术“CRISPR-Cas13a”融合的想法，开发了世界上最快的新型冠状病毒 据研究小组称，在该检测法中，在核酸切断酶“Cas13a”和切断后会发光的荧光功能分子“荧光报告器”的混合液中混合检测体。 检测体中有新型冠状病毒RNA时，会形成病毒RNA和Cas13a的复合体。 这个复合体有切断荧光报告器的作用，发光通知病毒的存在。 SATORI法是使用这个原理诊断有无感染的结构。 可以在5分钟以内这一世界最快的短时间内进行判定。

基于SATORI法的新型冠状病毒检测原理(由理研东大京大的研究小组提供)

SATORI法的特点是使用了微芯片技术。 微芯片上排列着1厘米见方的微小试管约100万个。 因为有病毒RNA的话，在各个微小试管中发光，所以也可以在病毒1分子水平上进行判定，也可以通过计算发光数来调查病毒量。 检测灵敏度为每微升病毒RNA约1000个。 研究小组表示，虽然核酸检测较差，但满足了从感染者标本中检测病毒RNA含量的灵敏度。 据说成本也比PCR的5美元左右高，但是可以以9美元左右的比较便宜的价格进行检查。

据说如果存在新型冠状病毒的话，在微芯片上的微小试管中发光(理研东大京大的研究小组提供)。

SATORI法除了诊断其他传染病外，还有望应用于癌症等疾病的生物标志物。 一系列的研究是在科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业( CREST )和日本医疗研究开发机构( AMED )等的研究支援下进行的。 研究成果刊登在19日的科学杂志《通讯生物学》电子版上。相关链接

2021年4月19日 物理化学研究所 东京大学 京都大学 科学技术振兴机构 研制了新型冠状病毒的超高灵敏度世界最快检测技术 - -期待作为通用的传染病诊断技术的应用展开-

由理化学研究所(理研)开拓研究总部渡边分子生理学研究室主任研究员渡边力也、筱田肇研究员、东京大学尖端科学技术研究中心教授西增弘志、该大学研究生院理学系研究科教授濡木理、京都大学病毒再生医科学研究所教授野田岳志等人组成的联合研究小组，组成了来自新型冠状病毒( SARS-CoV-2 )的病毒 本研究成果有望作为包括开发新型冠状病毒肺炎( COVID-19 )等超高灵敏度快速诊断装置在内的下一代传染病诊断法的核心技术得到应用。 现在，新型冠状病毒的确诊主要进行的是将病毒RNA纯化后，通过PCR法[1]等进行放大后检测的核酸检测。 但是，核酸检测检测最短需要1个小时左右，还会发生检测错误，因此难以短时间且高精度地分析大量检测体。 此次，联合研究组将世界最先进的微芯片技术[2]与核酸检测技术CRISPR-Cas13a[3]融合，生成了世界上最快的新型冠状病毒检测方法“crispr-based amplification-free digital” SATORI )法”。 使用SATORI法，可以在5分钟内逐一识别和检测病毒RNA。 检测灵敏度为5毫微微型( fM、fM为1000兆型)，满足了检测新型冠状病毒感染者检测样本中病毒RNA量的灵敏度。 另外，还有运行成本便宜到9美元左右的优点。 本研究刊登在科学杂志《Communications Biology》的在线版( 4月19日:日本时间4月19日)上。

背景 目前，新型冠状病毒( SARS-CoV-2 )的感染诊断主要利用的是检测蛋白质抗原的方法(抗原检测)和放大病毒RNA进行检测的方法(核酸检测)，分别根据筛选、确诊等用途进行区分使用(。 疑似感染时，会进行使用抗原检查的筛选。 抗原检查可迅速、简便地检测出30分钟左右的病毒，因此适合于筛选，但由于检测灵敏度和特异度[4]低而引起的检测错误较多是个问题。 另一方面，在被用作下一阶段确诊的核酸检测中，使用专业技术和装置从检体中纯化RNA，然后经过扩增的过程直至检测。 核酸检测灵敏度高，适合确诊，但检测预处理最短需要1个小时左右，而且还会因放大而发生检测错误，因此难以迅速解析大量检测体，从而导致诊断。 因此，开发兼顾核酸检测“灵敏度高”和抗原检查“迅速简便”的新病毒检测方法成为当务之急。

图1传统的新型冠状病毒肺炎诊断方法 抗原检查是作为筛选用进行的，通过核酸检测确定诊断。

研究方法和成果 此次，联合研究小组通过推进理学和工学的异领域融合研究，成功开发出了在“1分子”水平上识别来自SARS-CoV-2的病毒RNA并在5分钟内检测出来的创新技术，并对该方法进行了“CrisPR-Based Amplificc”的分析 SATORI )法”。 SATORI法融合了渡边力也集团专业的“利用微芯片的酶反应单分子检测技术”和西增弘志濡木理学集团专业的“核酸切断酶CRISPR-Cas13a(Cas13a )”相关的先进技术，是特定的RRI法 的混合液作为生物传感器使用，可以高灵敏度、高精度、迅速检测样本中有无目标病毒RNA。 SATORI法检测病毒RNA的原理如下(图2 )。 1 )核酸切断酶Cas13a和荧光报告器的混合液中混入病毒RNA时，特异性地形成病毒RNA和Cas13a的复合体。 2 )复合体形成后，Cas13a的酶活性开启，荧光基团与消光基团相连的荧光报告器被切断。 将3 )2)的复合体和荧光报告器的混合液细分封入集成了100万个3毫升( fL、1fL为1000兆分之一升)的微小试管的微芯片阵列中，随着Cas13a的切断活性，进行了病毒RNA存在的试验 4 )将荧光信号的有无进行二值化[6]，根据该数字信号对有信号的微小试管的个数进行计数。 由于计数的试管个数相当于样本中病毒RNA的个数，因此可以在1分子水平上判别和检测病毒RNA的存在。

图2基于2 SATORI法的病毒RNA数字检测原理

核酸切断酶Cas13a与荧光报告器、检测体的病毒RNA混合后，特异性地形成病毒RNA和Cas13a的复合体。 复合体形成后，Cas13a的酶活性开启，荧光基团和消光基团连接的荧光报告器被切断。 将其细分封入微芯片阵列后，只有存在病毒RNA的微小试管的荧光信号会在1分钟以内上升。 对微芯片有无荧光信号进行二值化，根据该数字信号对有信号的微小试管的个数进行计数。 由于微小试管内只存在一个病毒RNA，所以计数的试管个数相当于样本中病毒RNA的个数。 使用SATORI法，可以在5分钟内逐一识别和检测病毒RNA (图3a )。 检测灵敏度为5毫微微勒( fM，1fM为千兆分之一勒)，用病毒RNA的量表示，每微升(μL，1μL为百万分之一升)约为103个(图3b )。 这个灵敏度与以前的抗原检查法的104~105个/μL相比高10~100倍，与核酸检测的10~102个/μL相比低10~100倍。 但是，由于SARS-CoV-2感染者标本中的病毒RNA量为103~106个/μL，因此可以说SATORI法满足了实施SARS-CoV-2感染诊断所需的灵敏度。

图3基于3 SATORI法的数字检测实例

( a )基于SATORI法的微芯片的荧光图像。 每个亮点相当于一分子病毒RNA。 ( b )病毒RNA的浓度与被确认为荧光信号的微小试管个数的相关关系。 检测灵敏度为5fM。 如果将其设为病毒RNA的量，则为3×103个/μL。

今后的期待 SATORI法是能够在“1分子”水平上识别病毒RNA并以世界最高速度进行检测的创新技术。 另外，由于SATORI法的运行费用约为9美元，与核酸检测的5美元左右大致相等，因此，今后随着消耗品的大量生产和检测装置的小型化，有望成为能够廉价、迅速、准确地诊断多种病毒感染症的新一代传染病诊断法(图4 )。 另外，由于SATORI法还可以应用于疾病生物标志物的检测等，因此有望成为以癌症等基础性疾病的早期分层诊断等为目标的下一代液体生物传感器[7]的技术基础(图4 )。 本研究成果已申请专利，今后将与希望实用化的企业进行研究开发

图4液体生物传感器中SATORI法的未来展望 以从病毒感染症的多种迅速诊断到癌等基础性疾病的早期分层诊断的“核酸的数字化检测”为基础的新一代液体活检的印象。

补充说明 1.PCR法 PCR法是指聚合酶链反应法。 首先，将扩增对象的DNA、DNA合成酶( DNA聚合酶)、大量称为引物的寡核苷酸混合，制作反应液。 加热反应液后，双链DNA发生变性，变成单链DNA。 接着急速冷却的话，DNA聚合酶以结合(退火)的引物的3 '端为起点进行作用，合成与单链部分互补的双链DNA。 这样就形成了两倍量的DNA。 再次加热，从DNA变性开始重复。 这样，PCR法利用DNA链长不同引起的变性和退火的不同，仅通过温度的上下反复进行DNA合成，将DNA放大至2倍、4倍、8倍、16倍…。 PCR是polymerase chain reaction的缩写。 2 .微芯片技术 是指利用半导体制造工艺在芯片上成型微细结构的技术。 在本研究中，成型了集聚了约100万个容积3毫升的世界最小水平的微小试管的微芯片。 3 .核酸切断酶CRISPR-Cas13a 很多细菌都具备被称为“CRISPR-Cas系统”的获得性免疫系统。 参与VI型CRISPR-Cas系统的CRISPR-Cas13a是一种与导向RNA形成复合体，与导向RNA互补的单链RNA结合后被活化，切断单链RNA的RNA依赖性RNA切断酶。 4 .特异度 表示检查性能的指标之一。 正确地将阴性判定为阴性的比例。 5 .荧光报告器 用于检测靶RNA和Cas13a复合体的荧光功能分子。 在核酸的5个尿嘧啶( u )相连的单链RNA的两端，分别具有荧光基团和消光基团结合的结构。 由于复合体具有特异性切断尿嘧啶相连的结构的性质，因此荧光报告器被复合体切断后，荧光基团从消光基物理上解离，发出荧光。 6 .二值化 设定基准阈值，将荧光强度低于阈值的状态转换为“无荧光信号(0)”，将高状态转换为“有荧光信号(1)”的二值。 7 .液体生物传感器 以分析对血液和尿液等身体负担小的低侵袭性液体样本为基础的基础性疾病感染症诊断方法。

联合研究小组 理化学研究所开拓研究总部渡边分子生理学研究室 主任研究员渡边力也 研究员筱田肇 研究员安藤润 特别研究员(研究当时)田口裕也(千口裕也) 技术人员ⅰ牧野麻美 技术人员ⅱ高桥千春 东京大学尖端科学技术研究中心 教授西增弘志 学术专业职员冈崎早惠 东京大学研究生院理学系研究科 湿木理教授 研究生中川绫哉 京都大学病毒再生医科学研究所 教授野田岳志 助教中野雅博 助教村本裕纪子 研究支援 本研究由科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业CREST“为阐明细胞外微粒引起的生命现象及其控制创造基础技术( JPMJCR19H5 )”、三菱财团自然科学研究特别资助“新型冠状病毒等传染病相关学术研究资助”、 日本医疗研究开发机构( AMED )病毒等传染病对策技术开发事业( 20he0622032h0001 )、针对新兴复兴传染病的革新性医药品等开发推进研究事业( 19fk0108113436、20fk0108270h0001 )、JSPS科研费jp200 h 001 )

原論文情報 Hajime Shinoda，Yuya Taguchi，Ryoya Nakagawa，亚纱美牧野，Sae Okazaki，Masahiro Nakano，Yukiko Muramoto，Chiharu Takahashi，高桥郁子，Jun Ando，Takeshi Noda Osamu Nureki，Hiroshi Nishimasu，Rikiya Watanabe，“用CRISPR-Cas13进行无扩增RNA检测”，通信生物学，10.1038/s 2003-021-02001-8新規タブで開きます 発表者 理化学研究所 開拓研究本部 渡邉分子生理学研究室 主任研究員 渡邉 力也(わたなべ りきや) 研究員 篠田 肇(しのだ はじめ)

渡边力也 东京大学尖端科学技术研究中心 教授西增弘志 东京大学研究生院理学系研究科 湿木理教授 京都大学病毒再生医科学研究所 教授野田岳志 新闻负责人 理化学研究所宣传室新闻负责人 呼叫表格在新标签中打开 东京大学尖端科学技术研究中心宣传情报室 03-5452-5424 电子邮件:美国职棒大联盟 京都大学国际宣传室 075-753-5727和传真: [phone] 电子邮件: comms电子邮件2.ADM.Kyoto-u.AC.JP 科学技术振兴机构宣传科 03-5214-8404和传真: [phone] 电子邮件:日本航空 产业利用咨询 呼叫表格在新标签中打开 关于JST事业的事情 科技振兴机构战略研究推进部生命创新小组 保田睦子 03-3512-3524和传真: [phone] 电子邮件: crest JST.GO.JP ※请将上述[at]替换为@。

渡边力也 东京大学尖端科学技术研究中心 教授西增弘志 东京大学研究生院理学系研究科 湿木理教授 京都大学病毒再生医科学研究所 教授野田岳志 新闻负责人 理化学研究所宣传室新闻负责人 呼叫表格在新标签中打开 东京大学尖端科学技术研究中心宣传情报室 03-5452-5424 电子邮件:美国职棒大联盟 京都大学国际宣传室 075-753-5727和传真: [phone] 电子邮件: comms电子邮件2.ADM.Kyoto-u.AC.JP 科学技术振兴机构宣传科 03-5214-8404和传真: [phone] 电子邮件:日本航空 产业利用咨询 呼叫表格在新标签中打开 关于JST事业的事情 科技振兴机构战略研究推进部生命创新小组 保田睦子 03-3512-3524和传真: [phone] 电子邮件: crest JST.GO.JP ※请将上述[at]替换为@。