如何理性、高效地应用 NGS？听听协和王京岚教授怎么说！
以下为文字版：
青年女性，发热，糖尿病酮症酸中毒，Ⅰ 型呼吸衰竭，低血压休克；双肺多发沿支气管血管束分布的结节及团片影，右肾被膜下混杂密度影。
入院后除纠正糖尿病酮症、抗休克、使用有创机械通气外，经验性的使用了亚胺培南 1 g q6 h、万古霉素 1 g q12 h 和莫西沙星 0.4 g qd 的抗感染治疗。本院所查外周血和 BALF 的细菌培养结果均为阴性；而同时送院外的 NGS 结果回报却均为肺炎克雷伯菌。
治疗约 1 周后为患者做了 CT 引导下的肾周穿刺引流，此次我院微生物室及院外 NGS 回报均为「播散性高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）」。患者按血行播散型肺炎克雷伯菌感染治疗后安然出院。
在这 3 个阳性结果中，有两个是在关键时刻由 NGS 提供的。就此，我们看到了在常规微生物学检查阴性时，NGS 检查所起到的举足轻重的作用。
mNGS 首次应用于临床的报道是出现在 2014 年新英格兰杂志上的一例个案：通过 NGS 诊断脑钩端螺旋体感染；国内速度也不慢，2015 年，上海、天津和北京的相关机构就联合对 7 例发热待查的患者进行 NGS 检测；2016 年，通过 NGS 诊断的第一例败血症休克的患者见著报道。2019 年发表于新英格兰杂志的前瞻性研究表明，NGS 可以提高中枢神经系统感染的微生物学诊断成功率。
国内方面彭劲民和杜斌教授回顾性分析了在免疫力低下的人群中，NGS 对于诊断肺炎的作用，结论主要有两点：第一，对于少见微生物，NGS 效果好；第二，NGS 联合传统的微生物学检测方法，效率更高。
「与其相信 NGS（或者其他的各种化验），不如相信我们自己！」这是我们大夫，尤其是内科大夫的立命之本。
在临床上，我们给患者做化验、使用药物，都是围绕我们的诊断、治疗目的而去的。当化验结果、病情变化出现时，首先要做的就是看这些结果和变化与我们的既定目标是否吻合、哪里吻合？哪里不吻合？为什么不吻合? 这都需要通过医生的临床思考去得出结论。
我们一定要记住，NGS（或其他的各项化验）是为我们（临床）服务的，而不是我们（临床）为它们服务；再加上各种化验出现偏差的情况屡见不鲜；所以，一定要用自己的临床思维去考虑你碰到的一切问题，不管结果是阳性还是阴性。
mNGS（metagenomic Next Generation Sequencing）是通过对临床样本的 DNA 或 RNA 进行鸟枪（shotgun）法测序，可以无偏倚、无偏差地检测多种病原微生物（病毒/细菌/真菌/寄生虫）的一项技术。
作为临床医生，有两个名词是需要掌握的。
1. 诊断时间大大缩短：最快的 24 小时内即可出结果
2. 诊断的阳性率高：因为传统常规微生物检测比较容易受到微生物数量的影响，比如一用抗菌素后，细菌的数量至少下降一个数量级。而对于 NGS 来说，只要有病原体的基因存在，用不用抗菌素与我无关。
3. 发现的微生物种类多：因为目前有许多微生物尚无法通过传统常规手段去快速培养取得，常见如：支原体、衣原体、军团菌等。
4. 在病毒诊断方面，NGS 无需提前筛选病原体的范围，甚至能发现新的病原体。现今常规病毒病原体以免疫学检测为主，辅助 PCR 等手段，但它们均是对已知病毒的验证性检测，无法检测出未知的病毒。而 NGS 从基因层面可以发现更多、更新的病毒，例如新冠病毒，临床发现有问题，送 NGS 发现它与 SARS 高度相似，从而确定为新型冠状病毒。
5. 有望弥补对寄生虫感染检查的不足：常规寄生虫病确诊主要依据各种体液的镜检或免疫学检查，这对样本的收集要求、试验者的经验要求都很高，而基因组学则无需如此。
但是，我们必须要知道的是：目前公认的细菌性病原体诊断的「金标准」仍是传统培养法。
1. mNGS 无法确定它所检测到的序列是来自活菌还是死菌；所以，它依旧不能解决一直困扰我们的：如何鉴别定植菌和致病菌的问题。所以，检测出 DNA 只能表明存在何种生物，不能表明其是否存在生物学活性；也许检测出 RNA 会对此有帮助—RNA 的存在可以提示这种生物具有转录活性。
2. mNGS 仅限于粗略判断病原微生物的种类和估算微生物的大致比例（以序列读取总数的百分比来量化病原体读取量）。如果这个病原微生物在所在菌属中所占比例特别少，是极有可能产生阴性结果的。所以，阴性 mNGS 结果可能仅仅反映了样本的非微生物核酸成分（分母）高和/或微生物核酸成分（分子）低，而并不是病原体的缺乏。
3. 一些低含量的胞内细菌，如：结核杆菌、军团菌、布鲁氏菌和细胞壁较厚的真菌的检出率会较低（后者需要特殊处理来破坏细胞壁、暴露 DNA）。所以，对于所有类型的病原体，在相同的 DNA 提取技术下，其核酸回收率可能是不相等的。而这又产生了一个问题：检查不同目标微生物的标本，是否也需要有不同的提取方法？
4. 相同的标本送到不同的试验/实验室，其结果可能会不同——因为现在尚无统一的操作程序及标准。临床上确实见到过这种不一致的现象。
5. mNGS 的阅读核酸序列相对较短（300bp），很难获取耐药基因全长序列等信息；也不能将耐药基因与相应的微生物物种进行关联。三代测序的长度可以达到 1200bp，有可能覆盖耐药基因全长，对耐药基因的测定是好的帮助。
6. 试验中选择对照标本的问题：
阳性对照应涵盖血液样本中可能遇到的微生物范围，如：包膜和非包膜病毒，RNA 和 DNA 基因组，革兰氏阳性、阴性菌，霉菌和寄生虫。但是，我们事前并不知道待测标本中含有何种病原体，那阳性对照应该选择谁？不选谁？
阴性对照也同样有问题，因为水和样品基质不能充分反映正常健康血液（其他）标本中存在的背景。
7. 如何在从标本采集到处理、以及环境的步骤中避免核酸的污染，目前尚无标准化的协议。
8. 如何解释测序实验室产生的结果：这是目前 mNGS 临床实践中最令人头痛的问题之一。一些机构已经实施了精准医疗团队——由微生物学、计算生物学、传染病学和其他临床医生组成，在报告前讨论结果并提供对结果的解释。这可能是目前的最佳选择。
9. 在血液标本的 mNGS 测定中，现在尚无法区分致病菌与短暂的菌血症以及白细胞内所含微生物核酸片段的差别。在血标本的取样过程中，取血部位应如何消除正常菌群的干扰？取血部位应该是几个？取血量应该是多少？等尚无循证数据的支持。
总之，mNGS 目前并不能取代当前的传统微生物检验方法，而是应该视其为这些传统方法的一种补充。
我们以《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》（中华检验医学杂志 February 2021, Vol. 44, No. 2 ）为蓝本，看看 mNGS 应该如何应用于临床、了解 mNGS 所面临的挑战。
（一）临床适应证：
总结：1. 考虑感染性疾病，常规病原学检查阴性，规范性经验性抗感染治疗无效者。2. 危重症、免疫力低下且不排除感染者（我们案例中的患者符合此点）。
注意：这两类患者一定要在行常规病原学技术检测的同时，进行 NGS 检查。
（三）耐药学适应证
总结：总体的意见是负相的！我们上面说过，mNGS 的阅读核酸序列相对较短（300bp），很难获取耐药基因全长序列等信息，也不能将耐药基因与相应的微生物物种进行关联。
【注】90% 以上一致同意，则该共识描述为「建议」；70-90% 同意，则该共识描述为「考虑」；70% 以下则不纳入共识推荐。
（五）mNGS 应用于感染性疾病的报告解读：
【共识 30】mNGS 检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口）。确认致病微生物时，应考虑检出微生物是否为感染部位的潜在病原。如脑脊液检出新型隐球菌，呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病毒、流感病毒，关节液或血液标本检出布鲁菌属，均可认为是致病微生物。注意排除常见定植菌、污染菌与工程菌的影响。
总结：首先要弄清楚，报告的病原体是来自有菌区域还是无菌区域？这两个部位的含义是不一样的。无菌区域的结果较有菌区域的结果可信，此时需要考虑更多的是定植/污染/工程菌的影响问题。而文中对有菌区域结果的描述也不是绝对的，若有与临床不符的情况，仍需认真考虑、慎重对待；此外，呼吸道标本中还要考虑病毒（如鼻病毒）的定植问题。对发现的常见病毒，仍需进行（RT）PCR 的复检。
【共识 31】血浆样本对 cfDNA 进行 mNGS 检测时，建议从临床的角度鉴别检出序列属于致病微生物、样本污染、死亡微生物裂解，还是定植菌群所致的一过性菌血症。
总结：游离脱氧核糖核酸（cell-free DNA，cfDNA）：循环中的 cfDNA 分子来源于濒死的人类细胞和定植或侵入的微生物，在分解时将核酸释放到血液中。
由于 mNGS 无法确定它所检测到的序列是来自活菌还是死菌，所以上述的建议要求在临床角度很难实现。我们只能依靠自己的临床思维「去伪存真」、接近真相。
【共识 32】mNGS 报告中常规容易培养的病原菌，建议临床医师结合传统方法，综合判断其临床价值。
总结：细菌性病原体的「金标准」依旧是传统培养法；传统与新技术同步，取长补短。
【共识 33】建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物，如分枝杆菌属、诺卡菌属、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属与双相真菌）等，即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证，如特异引物的 PCR 或一代测序等分子生物学检测，G 试验，GM 试验，曲霉菌 IgG 抗体或隐球菌荚膜多糖抗原等血清学试验。
总结：读长：测序仪单个测序反应所得到的碱基序列。读长长度指该碱基序列的碱基数，读长数量指测序获得的碱基序列的数量。报告中列出某种署名下的读长数，即为该微生物种属特异性片段的数量。我们原本就不能根据序列的多寡来判断致病菌的是与否。当遇到临床怀疑上述微生物、而结果不支持时，就更应该需要考虑到细胞壁破坏是否彻底的问题。同时，不应忽略传统手段的临床价值。
【共识 36】mNGS 结果为阴性，对于排除感染常具有较好的阴性预测值。但对于某些病原微生物，如结核分枝杆菌等，原始样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物，应考虑 mNGS 检测灵敏度较低，阴性预测性差，并不一定优于 PCR 等常规检测方案。
总结：对常见的、数量多的病原体，mNGS 的灵敏度非常好，应该可以检测出来——故此可以作为阴性排除。大家千万不要小看阴性排除的作用，结果不能告诉我们是什么、但能告诉我们不是什么，其意义也是非同寻常的。但对于某些样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物（如分枝杆菌等），因其检测灵敏度较低，阴性预测性就差。
【共识 34】采用 mNGS 进行病原微生物鉴定的同时，可以考虑检测耐药基因，但需要将耐药基因准确定位到具体的病原体上以明确其临床价值。即通过对 mNGS 测得序列进行具体病原体基因组组装之后，确定耐药基因位于哪个病原体上，位于质粒上还是位于染色体上。
总结：总体而言，耐药基因的运用因受技术的限制，价值有限。但当有些特定情况出现时，如（尤其是在无菌环境、单独）发现结核分枝杆菌、CMV、真菌等少见微生物时，耐药基因的价值就非同寻常了。
【共识 35】mNGS 对于新发或少见病原微生物的检出具有重要价值。建议解读报告单前应了解比对数据库的内容，明确其是否涵盖少见病原或新发病原。检出高致病性病原微生物，应及时与临床联系。
总结：对于新发现的病原、新出现的高致病力病原以及少见病原，实验室要与临床密切联系，高度合作。
【共识 37】建立 mNGS 病原诊断的阈值影响因素较多，包括测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患者状况，目前尚无统一公认的阈值，建议各实验室建立自已的阈值，并在临床工作中加以验证。
【共识 38】不同病原微生物读长对结果判断的影响：同等条件下（相同微生物，相同标本），如某一微生物检出的读长数量多，为致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因组大小不同（寄生虫 > 真菌 > 细菌 > 病毒），核酸提取效率存在差异 ［难易程度：病毒 < 革兰阴性菌 < 革兰阳性菌（不包括分枝杆菌、需氧放线菌等）< 真菌］，致病力也相去甚远，因此不能仅仅依靠读长多少来判断是否感染，建议同时考虑病原微生物种类差异与致病特性。
总结：这两条共识反应出专家们希望能为每种病原体建立一个诊断阈值的美好憧憬；但现实很骨感。这也从另一个侧面反应出了 mNGS 所面临的一系列挑战、以及临床综合分析在使用 mNGS 结果过程中的重要性—比如，难道某种微生物序列少，它就不是致病菌了？我们不该考虑该致病菌的毒力吗？不该考虑患者的基础疾病吗？这都需要通过我们的临床思维给出答案—而这再次印证了我的开场白「与其相信 NGS（或者其他的各种化验），不如相信我们自己！」
从以上的分析中，我们可以看到：mNGS 作为一种新的检测手段，拓宽了微生物检查的途径和范围、弥补了常规检测手段的一些缺憾。它可以成为未来技术革命的基础；但是，目前它还并不是一种颠覆性的手段，而只是既往常规手段的补充和延伸。我们在常规检测中所面对的问题，在 mNGS 中依然要面对；这一点并没有变。比如：如何鉴别致病菌和定植菌？数量多就是致病菌？某某阴性就不是致病菌？等等。所以，我们要认识到：临床的综合思维依旧是现今临床感染性疾病诊治的核心，mNGS 只是为这个核心提供了一种新的手段。
本文由言瑾整理自王京岚教授的专题报告《呼吸与危重症医生眼中的 NGS》，感谢王京岚教授的审阅！