伏隔核中的Mitofusin-2通过线粒体和神经元活动调节焦虑和抑郁样行为
高度焦虑是一种将事件视为威胁的行为倾向，与消极情绪相关，容易转变为抑郁症。然而，人们对高特质焦虑与抑郁症之间共病的神经生物学基础知之甚少。巴黎综合理工学院生命科学学院的Elias Gebara、Olivia Zanoletti等发现伏隔核（NAc）的线粒体融合蛋白2（Mfn2）可以通过改变线粒体和中等多棘神经元（MSNs） 结构和功能的作用对焦虑和抑郁样行为进行调节。因此Mfn2 可作为治疗焦虑和相关行为障碍有希望的治疗靶点。
课题背景：新出现的证据指出线粒体在精神疾病中的核心作用, 然而，关于线粒体如何参与焦虑和抑郁神经回路的调节，以及它们如何影响神经元结构和功能知之甚少。为进一步研究来自MSNs中线粒体动力学的作用，该研究团队以成年雄性Wistar大鼠作为实验对象，通过腺病毒转染的方法成功制备高焦虑样模型鼠，对其进行了动物行为实验、线粒体呼吸测定、电生理学、免疫组化、形态学分析、电子显微镜和统计等检验。
1、高特质焦虑大鼠在抑郁相关测试中表现出动力降低
根据在高架十字迷宫 (EPM) 的开放臂停留时间对雄性大鼠焦虑样行为进行评估，将大鼠分为高焦虑（HA，开放臂停留时间≤5%）或低焦虑（LA，开放臂停留时间≥20%）。实验表明，HA 大鼠新物体 (NO) 测试中嗅探物体的潜伏期更长，在旷场中心花费的时间更少，并且表现出更多的触指行为。通过进一步对来自这两个测试的行为数据进行Z比分数，证实HA 和 LA 大鼠的焦虑样行为存在差异。此外，在快感缺失的测试中，HA大鼠表现出比LA大鼠低的糖水偏好的趋势；在强迫游泳测试 (FST) 中，HA大鼠表现出更高的悬浮不动时间，这些结果表明HA大鼠表现出与抑郁相关的动机缺陷。
2、高特质焦虑大鼠NAC中MSNs的树突复杂性和关联性降低
为了探讨特质焦虑的差异是否与NAc的中MSNs的结构和功能差异有关，该研究团队在HA和LA大鼠的离体脑片中对NAc壳中MSNs的微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）进行了全细胞记录。结果显示HA 大鼠mEPSCs的频率降低而峰值幅度没有差异。从电生理记录中获得的生物细胞素填充的MSNs的共聚焦分析显示HA大鼠的树突分化较LA大鼠少，树突总长度较短。此外，HA 大鼠还表现出较低的棘密度，这表明HA较LA出现了形态上的改变。为了研究焦虑与树突棘成熟度的关系，根据棘头的最大直径将树突棘分为两类，与LA大鼠相比，HA大鼠显示出更多的细棘和更少的蘑菇棘。通过对另一组动物进行高尔基染色形态计量分析证实了这些发现。这证实了HA大鼠MSNs中树突萎缩，包括较短的树突长度和较低的棘密度。此外，HA大鼠中细棘的相对数量更高，而蘑菇棘的数量低于LA大鼠。
Figure1.在具有不同特质焦虑的大鼠中观察到不同的行为和伏隔核表型
3、高特质焦虑大鼠在NAc中显示出较低的线粒体-内质网接触
通过离体高分辨率呼吸测定法，该研究团队在当前的实验条件下证实了HA 大鼠NAc线粒体功能的损害，如较MSNs低的复合物I活性。鉴于线粒体形态和功能之间的密切耦合，该团队在LA和HA大鼠的NAc中进行了电子显微镜分析，以评估线粒体形态和细胞器间相互作用的不同参数。结果表明两组的线粒体总数没有差异而HA大鼠呈现较大的线粒体面积和线粒体组织覆盖，其形态提示线粒体轻度肿胀。该团队随后分析了线粒体-内质网接触，与LA大鼠相比，HA大鼠的线粒体-内质网接触数量要少得多。此外，HA大鼠显示出更多数量的线粒体-线粒体 (mito-mito) 接触。总而言之，这些结果表明HA和LA焦虑大鼠在线粒体功能、形态及与NAc神经元中的内质网连接等几个参数方面存在差异。
Figure2. 不同的特质焦虑与不同的线粒体功能有关
4. 高特质焦虑大鼠在NAc中等多棘神经元中显示出较低的Mfn2水平
该团队测量了NAc中Mfn2、丝裂融合蛋白1(Mfn1)、视神经萎缩蛋白(OPA1)和动力蛋白相关蛋白1(DRP1)的mRNA水平，发现HA中Mfn2 mRNA 的表达低于LA大鼠。此外，使用蛋白质印迹分析进一步证实HA大鼠NAc组织中的Mfn2蛋白表达低于LA大鼠。为了量化特定NAc细胞类型中Mfn2的水平，该团队进行了RNAscope分析。HA大鼠在NAc壳中的D1和D2神经元中的Mfn2表达低于LA大鼠。通过免疫组化分析证实，HA大鼠的NAc壳中这种蛋白质水平较低，而在大脑皮层和中央以及基底外侧杏仁核中没有发现差异。在NAc核中， HA中Mfn2的表达均低于LA大鼠。此外，在缺乏D1和D2受体的细胞中，无论是在NAc的核或壳亚区，Mfn2的表达都没有组间差异。
Figure3. 不同的特质焦虑与不同的线粒体动力学和 MFN2 降低有关
5、MFN2在HA大鼠NAc 中的过表达使线粒体参数和线粒体-内质网接触正常化
该团队试图通过注射过表达MFN2的 AAV提高NAc的MfN2水平使HA大鼠的细胞和行为正常化。结果表明，与HA假手术组大鼠相比，过表达Mfn2会显著增加HA大鼠NAc中Mfn2在mRNA和蛋白质水平上的表达，并将HA线粒体呼吸能力恢复到LA大鼠水平，且不会影响线粒体形态。此外，Mfn2 过表达会减少HA 大鼠的线粒体分布和呼吸能力，增加线粒体-内质网的接触，使 HA 大鼠的线粒体特征正常化。为了更好地了解线粒体结构，该团队对NAc壳中的线粒体网络进行了3D重建。这些分析表明HA大鼠增加的线粒体体积会由于Mfn2 过表达趋向正常，当在树突线粒体中进行分析时，HA大鼠线粒体体积明显增加。而线粒体数量和长度既不受焦虑也不受 Mfn2 过表达 的影响。
Figure 4. NAc中过表达MFN2使线粒体功能正常化
6、MFN2在HA大鼠NAc中的过表达使神经元和行为表型正常化
电生理记录发现在HA大鼠的NAc中MSNs的mEPSCs的频率减少， 其Mfn2过表达后可恢复到与LA大鼠相当的水平。高尔基染色显示过表达HA大鼠中的Mfn2能够使HA大鼠中观察到的减少的树突分支和棘突形态异常恢复至LA大鼠的水平。行为学结果显示过表达NAc中的Mfn2可以增加HA大鼠在EPM开放臂进入时间和糖水偏好系数、降低强迫游泳中悬浮不动的时间即可以改善HA大鼠的焦虑及抑郁行为。这些结果表明NAc中MSNs的Mfn2的水平与大鼠神经元和行为表型的焦虑抑郁程度有因果关系。
Figure 5. HA 大鼠 NAc 中的 MFN2 过表达 使细胞和行为表型正常化
巴黎综合理工学院生命科学学院的Elias Gebara、Olivia Zanoletti等在 NAc的MSNs 中为 Mfn2 建立了一个机制链接，以调节涉及伏隔核环路的行为。重要的是，该团队表明这种从分子到行为的联系是由Mfn2与线粒体和神经元的关键结构和功能的调节作用介导的。具体来说，高度焦虑的大鼠NAc壳中MSNs的MFN2的缺陷是：（1）线粒体的最大呼吸能力降低、体积增加，以及与内质网的相互作用减少;(2) MSNs，包括较少的树突复杂性、降低的棘密度和类型，以及兴奋性突触传递的减少；(3)行为，包括类似焦虑的行为、动力降低和糖水偏好降低。这些研究结果表明，Mfn2 介导的线粒体和神经元改变对于调节焦虑和动机行为至关重要，从而确定线粒体在调节大脑功能和行为中的新作用。
所涉及的行为学实验
高架十字迷宫实验：啮齿类动物（例如大鼠、小鼠）有探究行为，放入高架十字迷宫后会主动探究开臂，但又惧怕开臂中髙悬敞开的环境。抗焦虑药物能够増加开臂探究活动，致焦虑剂则相反。以小鼠实验系统为例，包括2个35 cm×6 cm的相对开臂和2个35 cm×6 cm的相对闭臂，闭臂上部敞开，开臂四周均敞开，开臂与闭臂之间中央有一个5 cm×5 cm的相对开阔部。迷宫离地面高50 cm。将小鼠置于中央开阔部，头朝闭臂。行为分析软件记录5 min内小鼠进入开臂与闭臂的次数和两臂滞留的时间（以四肢全部入臂或出臂为标准）。计算小鼠进入开臂的次数与时间分别占总次数（两臂次数之和）和总时间（两臂滞留时间之和）的百分比（占比）。
糖水偏好实验（SPT）：动物们被单独饲养，正常饮水2天2瓶，然后是2天2瓶2%的蔗糖。之后动物被剥夺24小时的水，然后在黑暗阶段被暴露在一瓶2%的蔗糖和一瓶水中2小时。1小时后切换瓶位。测量每种液体的总消耗量，并将蔗糖偏好定义为第一和第二小时内的平均蔗糖消耗比例。蔗糖消耗比是用蔗糖的总消耗量除以水和蔗糖的总消耗量。
强迫游泳实验（FST）：将动物单独放置在盛有水（23-25°C）的圆筒（直径：12cm，小鼠身长：25cm；直径20cm，大鼠身长：50cm）中，正常光线下游6min。水深的设置是为了防止动物用尾巴或后肢接触到底部。从侧面记录动物的行为。采集参数：最后4min强迫游泳测试中的不动时间。不动时间被定义为动物漂浮或静止，只保持水中保持平衡所需时间。若实验对象为大鼠，在实验前24小时需进行预试验，条件如上所述，时间为15min。对于光遗传学操作，将小鼠置于水中后立即进行激光刺激，时间为6min。为尽量减少光遗传学电缆对游泳行为的影响，需调整电缆的长度，使电缆只接触水面。
旷场实验（OFT）：动物被放置在一个昏暗光线房间的箱体中心（小鼠：40cm×40cm×40.5cm，大鼠：100cm×100cm×50cm），箱体正上方的摄像机用来跟踪每只动物的运动情况。在昏暗灯光下放置10min并记录。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biopsych.2020.12.003
（山东中医药大学中医药与脑科学研究创新团队 陈志彬 供稿）