PNAS|超越CRISPR，RLR新基因编辑工具问世
哈佛大学怀斯生物工程研究所研究人员发明了一种新的基因编辑工具，称为反转子文库重组工程（Retron Library Recombineering，RLR）（反转子（retron）是由逆转录酶（RT）和非编码RNA（ncRNA）组成的细菌遗传元件），它可以同时产生多达数百万个突变，并对突变的细菌细胞进行“条形码”编码，这样就可以一次对整个库进行筛选，从而可以轻松生成和分析大量数据。它可以在CRISPR有毒或不可行的情况下使用，并且可以提高编辑率。
研究人员已经创建了一种称为Retron Library Recombineering（RLR）的新基因编辑工具，该工具可以同时生成多达数百万个突变，并“编码”突变细菌细胞，以便可以一次筛选整个库。 它可以在CRISPR有毒或不可行的情况下使用，并导致更高的编辑率。
CRISPR-Cas9基因编辑系统已成为合成生物学创新的典范，但它具有一些主要局限性。 可以对CRISPR-Cas9进行编程，以发现和切割特定的DNA片段，但是编辑DNA以产生所需的突变需要诱使细胞使用新的DNA片段来修复断裂。 这种诱饵转换可能很复杂，甚至可能对细胞有毒，因为Cas9经常还会切割意外的脱靶位点。
替代基因编辑技术称为重组，而是通过在细胞复制其基因组时引入另一种DNA来执行这种诱饵转换，从而有效地产生基因突变而不会破坏DNA。 这些方法非常简单，可以立即在许多细胞中使用，以创建复杂的突变库，供研究人员进行研究。 但是，要弄清楚这些突变的作用是什么，就需要对每个突变体进行分离，测序和表征：这是一项耗时且不切实际的任务。
哈佛大学和哈佛医学院（HMS）的Wyss生物启发工程研究所的研究人员创建了一种名为Retron Library Recombineering（RLR）的新基因编辑工具，该工具使这项任务变得更加容易。 RLR同时生成多达数百万个突变，并对突变细胞进行“条形码”，以便可以一次筛选整个库，从而可以轻松生成和分析大量数据。 在PNAS中的最新论文中描述了在细菌细胞中已经实现的这一成就。
共同第一作者说：“ RLR使我们能够进行CRISPR不可能完成的工作：我们随机切碎了一个细菌基因组，将这些基因片段原位转化为单链DNA，并利用它们同时筛选了数百万个序列。” 马克斯·舒伯特（Max Schubert）博士，Wyss核心学院成员乔治·丘奇（George Church）博士后实验室。 “ RLR是一种更简单，更灵活的基因编辑工具，可用于高度多重实验，从而消除了CRISPR经常观察到的毒性，并提高了研究人员在基因组水平上探索突变的能力。”
回顾：从谜题到工程工具
逆转录是细菌DNA的片段，它们经过逆转录产生单链DNA（ssDNA）的片段。 Retrons的存在已有数十年之久，但他们产生的ssDNA的功能却从1980年代一直持续到2020年6月，当时一个团队终于弄清了ssDNA能够检测出病毒是否感染了细胞，从而构成了细菌免疫的一部分。 系统。
虽然逆转录原本只是简单地视为细菌的一个怪癖，但研究人员在过去几年中对它们越来越感兴趣，因为它们像CRISPR一样，可以用于细菌，酵母菌甚至人类细胞中的精确而灵活的基因编辑。
“很长一段时间以来，CRISPR一直被认为是细菌所做的一件奇怪的事情，并且弄清楚如何利用它进行基因组工程改变了世界。逆转录是另一种细菌创新，也可能会提供一些重要的进步，” Schubert说。 由于其在细菌中产生ssDNA的能力，几年前激起了他对Retron的兴趣-这是一种在称为寡核苷酸重组的基因编辑过程中使用的引人注目的功能。
基于重组的基因编辑技术需要将包含所需突变的ssDNA整合到生物体的DNA中，这可以通过以下两种方式之一完成。 可在修复过程中对双链DNA进行物理切割（例如，使用CRISPR-Cas9）以诱导细胞将突变序列整合到其基因组中，或者将突变DNA链和单链退火蛋白（SSAP） 将其引入正在复制的细胞中，以便SSAP将突变链整合到子细胞的DNA中。
“我们认为逆转录应该使我们能够在我们想要编辑的细胞内产生ssDNA，而不是试图将它们从外部强迫进入细胞内，而又不会破坏天然DNA，这两个都是非常引人注目的品质，”研究人员说。 第一作者丹尼尔·古德曼（Daniel Goodman）博士，曾任威斯研究所（Wyss Institute）研究生院研究员，现为UCSF的简·科芬·Childs博士后研究员。
逆转录的另一个吸引人之处是它们的序列本身可以用作“条形码”，以识别细菌池中的哪些个体已接收到每个逆转录序列，从而可以显着更快地汇总筛选精确创建的突变菌株。
为了了解他们是否真的可以使用逆转录来实现与逆转录的有效重组，Schubert和他的同事首先创建了细菌DNA的环状质粒，该质粒包含位于逆转录序列中的抗生素抗性基因，以及一个SSAP基因，可以将逆转录序列整合入 细菌基因组。 他们将这些逆转录质粒插入到大肠杆菌中，以查看在20代细胞复制后该基因是否成功整合到其基因组中。 最初，少于0.1％的带有逆转录重组系统的大肠杆菌掺入了所需的突变。
为了改善这种令人失望的初始性能，研究小组对细菌进行了几项基因调整。 首先，他们使细胞的天然错配修复机制失活，该机制纠正了DNA复制错误，因此可以在将其遗传给下一代之前“固定”所需的突变。 他们还使编码外切核酸酶的两个细菌基因失活-破坏自由浮动的ssDNA的酶。 这些变化极大地增加了整合逆转录序列的细菌比例，达到了人口总数的90％以上。
突变体的名称标签
既然他们确信自己的逆转录ssDNA已整合到细菌的基因组中，该团队就测试了他们是否可以将逆转录用作基因测序的“捷径”，从而可以在混合物中进行许多实验。 因为每个质粒都有自己独特的反转录序列，可以充当“名称标签”，他们认为它们应该能够对短得多的反转录序列进行测序，而不是对整个细菌基因组进行测序，从而确定细胞已接受了哪些突变。
首先，研究小组测试了RLR是否可以检测到大肠杆菌中已知的抗生素耐药性突变。 他们发现，与其他突变相比，包含这些突变的序列在测序数据中的占比要高得多。 研究小组还确定，RLR具有足够的灵敏度和精确度，可以测量由非常相似的突变引起的耐药性的微小差异。 至关重要的是，通过对整个细菌库中的条形码进行测序而不是对单个突变体进行分离和测序来收集这些数据，可以极大地加快这一过程。
然后，研究人员又将RLR向前走了一步，看看它是否可以用于随机片段化的DNA，并找出它们一次可以使用多少个逆转录。 他们切碎了对另一种抗生素具有高度抵抗力的大肠杆菌菌株的基因组，并利用这些片段建立了包含在质粒回溯序列中的数千万条基因序列的文库。 “ RLR的简单性在本实验中确实得到了体现，因为它使我们能够建立一个比我们目前可用于CRISPR的库更大的库，在该库中我们必须合成指导基因和供体DNA序列才能诱导每个突变，” 舒伯特说。
然后将该文库引入RLR优化的大肠杆菌菌株中进行分析。 研究人员再一次发现，通过对细菌库进行测序，它们相对于其他细菌富集的事实可以很容易地识别出赋予抗生素抗药性的逆转录病毒。
高级作者乔治说：“能够利用RLR分析合并的条形码突变库，可以同时进行数百万次实验，使我们能够观察到整个基因组突变的影响，以及这些突变之间如何相互作用。” 丘奇（Church）领导威斯研究所（Wyss Institute）的合成生物学重点领域，同时还是HMS的遗传学教授。 “这项工作有助于建立在其他遗传系统中使用RLR的路线图，这为未来的遗传研究开辟了许多令人兴奋的可能性。”
RLR与CRISPR区别的另一个特征是，随着细菌的复制，成功将所需突变整合到其基因组中的细菌比例会随着时间的推移而增加，而CRISPR的“单发”方法在首次尝试时往往会成功或失败。 RLR可能与CRISPR结合使用以改善其编辑性能，或者可以在CRISPR有毒性的许多系统中用作替代方法。
在RLR上还有更多工作要做，以提高和标准化编辑率，但是对于这种新工具的兴趣正在增长。 RLR简单，流线型的性质可以研究多个突变如何相互影响，并生成大量数据点，从而可以使用机器学习来预测进一步的突变效应。
Wyss研究所创始主任Don Ingber博士说：“这种新的合成生物学工具将基因组工程提高到更高的通量水平，这无疑将带来新的，令人兴奋的和意想不到的创新。” Ingber还是HMS和波士顿儿童医院的Judah Folkman血管生物学教授，还是哈佛大学约翰·保尔森工程与应用科学学院的生物工程学教授。
该论文的其他作者包括HMS的Timothy Wannier，华威大学的Divjot Kaur，麻省理工学院的Fahim Farzadfard和Timothy Lu，以及Gladstone数据科学和生物技术学院的Seth Shipman。
这项研究得到了美国能源部（DE-FG02-02ER63445）和国防科学与工程研究生奖学金的支持。
Journal Reference:
Max G. Schubert, Daniel B. Goodman, Timothy M. Wannier, Divjot Kaur, Fahim Farzadfard, Timothy K. Lu, Seth L. Shipman, George M. Church. High-throughput functional variant screens via in vivo production of single-stranded DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2021; 118 (18): e2018181118 DOI: 10.1073/pnas.2018181118
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