微生物基本技术操作要求！
食品实验室服务一、无菌操作要求微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。要求如下：1.1 接种细菌时必须穿工作服、带工作帽；1.2 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用；1.3 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手擦干净；1.4 进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用；1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边；1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到针和环与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼；1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。二、无菌间使用要求2.1 无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门，另尽量设有的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2.2 无菌间应保持清洁，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关的物品；2.3 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬掉紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离工作台1m处，照射时间不少于30分钟，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；2.4 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递；2.5 在无菌间需用安装空调时，则应有过滤装置。三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。3.1 灭菌前准备3.1.1 所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面气孔打开。3.1.2 装培养基的三角瓶塞好棉塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。3.2 装放3.2.1 大型高压蒸气锅：放置灭菌物品不应超过锅内容积的80%，物品应放置锅内搁架上或铁丝筐中。3.2.2 手提式高压锅：将物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。3.3 设备检查3.3.1 检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。3.3.2 压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。3.3.3 对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。3.4 灭菌处理手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：3.4.1 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需要更换）。3.4.2 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。3.4.3 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放出冷气（水沸腾后排气10～15min）。3.4.4 关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。3.4.5 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再打开盖取物，以防止突然减压液体剧烈沸腾活容器爆破。3.5 灭菌温度与时间3.5.1压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表：物 品灭菌时间，min115℃121℃不含糖等耐热培养基15含糖类等耐热培养基15～20染菌培养物30器械器皿303.5.2 灭菌处理：灭菌后物品，剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。3.5.3 取出的物品掉落在地或误放不洁之处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。3.5.4 取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。3.5.5 凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。3.5.6 每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。四、有毒有菌污物处理要求微生物实验室所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。4.1 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。4.2 经微生物污染的培养物，必须经121℃，30min高压灭菌。4.3 染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小时，再经121℃，30min高压灭菌。4.4 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须经高压灭菌后洗涤。4.5 打碎的培养物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。4.6 污染的工作服或进行烈性菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。五、玻璃器皿的清洗要求5.1 目的为了保证微生物实验顺利进行，保证实验结果的准确性，不影响实验进度，必须把器皿彻底清洗干净。5.2 注意事项5.2.1 任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。5.2.2 一般新的玻璃器皿用2%的盐酸液浸泡数小时，后用水冲洗干净。5.2.3 用过的器皿应立即洗涤，放置太久会增加洗涤困难。5.2.4 强酸、强碱及其它氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能倒在洗涤槽内，以免污染环境水质，必须倒在废水缸中。5.2.5 含有对人体有传染性病菌的器具，应先煮沸灭菌后再进行洗涤。5.2.6 难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起，以免增加洗涤的麻烦。有油的器皿不要与无油的器皿混在一起，否则使本来无油的器皿沾上了油垢，浪费药剂和时间。5.3 洗涤剂的种类：水、洗衣粉、柠檬洗涤剂、肥皂5.4 洗涤方法5.4.1 含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤方法：事先应将器皿中的琼脂刮去，然后用清水洗涤，并用试管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰尘和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自来水冲洗。洗好后的器皿应倒置晾干或置于干燥箱中干燥至无水滴。5.4.2 载玻片及盖玻片的洗涤法：新载玻片及盖玻片先在20%的盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗2~3次，最后用蒸馏水换洗2~3次。用过的载玻片及盖玻片，应用纸擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分钟后立即用自来水冲洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小时，再用自来水冲洗至中性。5.4.3 移液管、倒管的洗涤方法：新的移液管及倒管先在的５％盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗几次，最后用蒸馏水换洗几次。用过的移液管、倒管先用自来水洗去表面的残液，再放在洗衣粉水中浸泡一小时以上，再用自来水冲洗至管内壁无残渣，最后用蒸馏水换洗次，晾干后入恒温干燥箱中烘干。六、培养基、无菌水的制备6.1 基本原理培养基的种类很多，不同微生物所需要的培养基不同。培养基制成后的物理状态可分为液体、固体、半固体三种类型。6.2 器材三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、角匙、杜氏小管、硅胶塞、电炉6.3 培养基的种类营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(附加抗菌素)、平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白冻肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤、EC肉汤、高盐察氏琼脂、三糖铁琼脂等6.4 方法步骤6.4.1 培养基的制备：6.4.2 称量：根据培养基的配方，称取适量药品于搪瓷杯中；6.4.3 溶解：用量筒量取所需水量，置电炉上加热，一边搅拌，至完全溶解，加热至沸腾，拔掉电源，待冷却；6.4.4 分装：根据不同需要，立即趁热分装入三角瓶或试管中，分装三角瓶以不超过三角瓶一半为宜，分装试管一般为管长的1/5（需根据试管的大小而定）。液体培养基如乳糖胆盐发酵培养基约分装10毫升左右。6.4.5 塞硅胶塞：装好培养基的试管应塞上硅胶塞，松紧合适，紧贴管壁，不留缝隙，约1/2塞入内，这样即可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。6.4.6 包装：三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎，试管集中于试管篓。6.5 无菌水的制备：6.5.1 用10ml移液管量取9.2ml蒸馏水（稀释水）装入试管中。6.5.2 用100ml量筒量取95ml蒸馏水（稀释水）装入150ml的三角瓶中。可置少许玻璃珠于三角瓶内，防止暴沸。6.5.3 量取240ml蒸馏水（稀释水）于250ml的三角瓶中，塞上瓶塞用牛皮纸包扎好，高压灭菌备用。七、设备使用原则7.1 实验设备的使用由实验员严格按照操作说明书进行，其他人员不得随意操作。7.2 实验设备的日常维护保养由实验员根据设备操作说明书进行，出现不可排除的故障时，经部门总经理批准，商请专业人员维修。7.3 实验设备应定期进行计量检测，确保仪器的准确性。7.4 实验员应爱护仪器设备，使用前应检查，使用后应及时清理清洁，并定期维护保养，下班前应检查设备电源是否关闭。