有没有想过我们司空见惯的绿豆芽和氢气的关系？有没有想过在发豆芽过程中会产生大量的氢气？这些氢气是哪里来的？现在就从绿豆芽入手来看看氢气和线粒体的关系。
一、线粒体和叶绿体
动物细胞和植物细胞都是真核细胞，它们共同的特点是都有细胞核和细胞器。有两个细胞器与能量代谢密切相关，即线粒体和叶绿体，线粒体是所有真核细胞都有的，而叶绿体则是植物细胞特有的。线粒体是细胞的能量工厂，可以通过氧化磷酸化产生细胞需要的能量；叶绿体是光合作用的场所，可以把光能转化成化学能。线粒体和叶绿体的共同特点是在它们的膜上有电子传递链，通过电子和质子的分离以及电子的流动形成质子在膜两侧的浓度差，由此形成的电位差推动能量货币ATP的合成。
线粒体和叶绿体的能量转换。（a）线粒体中，在氧的高还原电位和线粒体中各种底物（燃料）的相对低还原电位的驱动下，电子自发地通过膜结合载体链移动传递给氧气（呼吸链）。（b）叶绿体中，水光解产生氧气和电子，由叶绿素吸收的光子能量驱动电子通过膜结合载体链的运动。在这两种细胞器中，在电子流动的同时，带正电荷的质子（H+)的跨膜运动产生电电位差，通过膜结合的ATP合成酶驱动ATP的合成。
看到这里是不是有种似曾相识的感觉：氢化酶催化的反应（ H2 ⇆ 2H++ 2e-）联结了氢气（H2）、质子（H+）和电子（e）这三个在生命能量代谢中的核心。如果细胞的线粒体有氢化酶的功能能够直接把氢气变成质子和电子那就有意思了。这个想法第一次想到是在2015年冬天，从此一直念念不忘想要证明。
从前边几篇的介绍我们已经熟悉，许多微生物可以通过氢化酶产生或分解氢气，也就是具有氢气代谢的能力。早在1896年Jackson等就发现蓝藻Anabaena具有放氢现象（Jacson, 1896），蓝藻是含叶绿素a，但不含叶绿体（区别于真核生物的藻类）、能进行产氧光合作用的单细胞原核生物，它的出现使整个地球大气从无氧状态发展到有氧状态，从而孕育了好氧生物的进化和发展。这是氧气与氢气共存于同一生物体的最早证据。
氢化酶被发现是在20世纪30年代（Stephenson，1931）。几年后Gaffron等研究发现绿藻Scenedesmus sp.D.3在“暗反应”中可以氧化氢气同时固定二氧化碳（Gaffron, 1939 & 1940），或在光照下释放氢气（Gaffron, 1942）。绿藻的细胞与高等植物相似，也有细胞核和叶绿体，有相似的色素、贮藏养分及细胞壁的成分。色素中以叶绿素a和b最多，还有叶黄素和胡萝卜素，故呈绿色。这是最早在低等真核细胞中发现氢气代谢。
现在很多研究集中在利用藻类产生氢气作为生物能源，关于低等植物氢气代谢有大量的研究也已经非常清楚。氢气的产生和利用是由于藻类具有氢化酶，在叶绿体中氢化酶可以与光合作用电子传递链的硫氧还蛋白（Fd）相互作用，从Fd接受电子产生氢气。近年来发现绿藻氢化酶的氢代谢与细胞的其他能量代谢也相关联（Maione，1986；Wang，2020）。
绿藻细胞中的氢化酶被激活后，绿藻就能在进行光合作用时产生氢气。然而这一过程非常微妙：氢化酶只能在缺氧环境下被激活，一旦遇到氧气，氢化酶就迅速失去活性；正常情况下，因为光合作用会产出氧气，氢酶总是处在失活状态。实际上，绿藻产氢更像是其在缺氧等“胁迫”情况下产生的一种应激反应。
2. 高等植物产生氢气
高等真核生物叶绿体氢气代谢的研究相对进展缓慢。1946年，Boichenko在分离出的叶绿体发现可以产生氢气, 并推测在某些高等植物体内也存在氢化酶（Boichenko，1946）。1964年Renwick等在冬黑麦、萝卜、豌豆、西红柿等高等植物的种子萌发中发现可以产生氢气（Renwick，1964），并证明这并非是由于种子携带的微生物污染造成的。
1982年，Mal'tsev S.V. 发现离体豌豆叶绿体能够产生和消耗氢气，但并无后续研究，有关高等植物吸氢酶活性只有这1篇报道（Mal'tsev，1982），遗憾的是我们仅能看到题目，估计是俄文文献，中间曾经联系杂志社均没有信息，未能找到全文，所以具体细节尚不清楚。近年来，陆续发现水稻、苜蓿和拟南芥等高等植物均可产生内源性氢气（Xie，2012；Zeng，2013；Jin，2013），在植物的基因组中也发现一些基因与氢化酶基因同源，并监测到植物中这些推测的氢化酶基因表达的变化，但尚缺少这些基因蛋白表达水平的确认和氢化酶功能的确认。
到目前为止，关于氢气和线粒体的研究主要集中在氢气清除线粒体产生的羟自由基保护线粒体方向，还没有检索到线粒体产生或利用氢气的报道，也就是说高等生物线粒体的氢代谢研究还是空白。
由于有多个实验研究证明种子萌发过程中可以产生氢气，我们首先用绿豆种子萌发（发绿豆芽）重复了这些实验。已报道的测定种子萌发产气的方法操作比较麻烦，无法准确定量，我们尝试几种方案后干脆直接用气相色谱使用的气谱瓶培养种子和豆苗，然后取气体样品用气相色谱检测，整个体系完全在一个密闭空间更方便准确定量研究。
分别将泡发后正常培养至0 h、24 h、48 h、72 h、96 h不同时间点的绿豆幼苗收集用于产氢的测定，分别把上述样品称重消毒后加入装有40 mL无菌水的气相色谱瓶中，一组氮气排氧（排氧组）另一组不排氧（常氧组），25±1℃密封黑暗培养14 小时，取1ml气体用气相色谱测定氢气和氧气的含量。
结果如图A所示，0h组的绿豆培养14小时后常氧和排氧两组均未产生氢气，但常氧组的氧气浓度已经明显下降（12.3% vs 21%）。培养24h以上的幼苗在气谱瓶培养14小时后耗氧比0h组明显增大（6.7% vs 12.3%），并开始产生氢气。氮气排氧之后，样品中氧气浓度显著降低，样品在气相色谱瓶中放置14 h后，剩余氧气含量均低于2% (B)。排氧条件下48 h和72 h幼苗的产氢量显著高于未排氧组(图A)。
气相色谱检测绿豆幼苗萌发过程中氢气的产生。A不同生长时期幼苗的产氢情况; B不同生长时期幼苗在氢气检测时同步检测氧气含量（Zhang X.,2020）
幼苗不同组织产氢情况。（Zhang X.,2020）
取培养96小时的幼苗将根、下胚轴、子叶+真叶分别在气谱瓶中密闭暗培养14 h小时后检测不同组织氢气产生情况。结果与整株幼苗类似，在低氧条件下它们都能产生氢气。一方面这个结果说明缺氧的环境对氢气产生的重要性；另一方面，根和下胚轴在种子萌发阶段应该没有发育的叶绿体，初步可以排除氢气来源于叶绿体的可能性，那么氢气是从哪里来的呢？与其他研究类似，我们也检测了预测的几个氢化酶基因在绿豆和辣椒种子萌发过程中在不同组织的表达情况。发现根部和下胚轴中氢化酶表达都比子叶中要高，而且如果用氢水处理，氢化酶基因的表达会受到抑制。
预测氢化酶基因在绿豆萌发过程中的表达情况。除了下胚轴中VrHypA基因在第60h时表达量最高外（图c），其余三个氢化酶同源基因VrNAR1、VrHycB、VrFrhB均随着培养时间延长，表达量增加，尤其在第120h时，转录水平达到最高值。
氢水对预测氢化酶基因表达的影响（120小时）。100% HRW能够显著降低辣椒幼苗的CaHycB和CaHypA基因的表达，在茎和叶中情况相同，其余基因表达情况无显著变化。
以上通过对绿豆发芽过程的研究发现，结果基本重复了其他研究团队的工作，证明种子萌发过程中确实可以产生大量氢气。
我们进一步的细化研究证明包括根、下胚轴在内的在种子萌发过程中不含叶绿体的组织都可以产生氢气，表明氢气的来源可能是除叶绿体外的其他结构。另外，我们建立了准确检测氢气和氧气变化的方法。这部分预实验为后边寻找氢气来源的研究奠定了基础。
下一篇将介绍线粒体产生氢气的实验数据。
氢气生物学机理专题
氢生物学2020：机理研究探索
生命中的氢元素
氢气是推动真核生物进化的关键
氢化酶
复合物 I 和氢化酶
氢气与乙酰胆碱酯酶
氢气与辣根过氧化物酶（1）
氢气与辣根过氧化物酶（2）
写在线粒体前
参考文献
马雪梅,张鑫,谢飞,赵鹏翔,张昭,仪杨,张晓康,马胜男,李秦剑,吕宝北,刘梦昱,YAO Mawulikplimi Adzavon,孙学军,李英贤.氢气生物学作用的生物酶基础[J].生物技术进展,2020,10(1):15-22.Zhang X, Zhang Zh, Wei Y, et al. Mitochondria in higher plants possess H2 evolving activity which is closely related to complex I [J/OL]. arXiv:2001.02132 [q-bio.BM], [2020-01-08]. https://arxiv.org/abs/2001.02132 线粒体产氢Zhang X, Zhang Zh, Su Z , et al. Hydrogen evolution and absorption phenomena in plasma membrane of higher plants [J/OL]. bioRxiv 2020.01.07.896852. [2020-01-08]. https://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.01.07.896852v1 细胞膜和氢气Jacson DD, Ellms JW. On odors and tastes of surface waters with special reference to Anabaena, a microscopial organism found in certain water supplies of Massachusetts, Rep. Mass. State Board Health ,1896:410-420. 最早的蓝藻产氢研究Stephenson M , Stickland L H . Hydrogenase: a bacterial enzyme activating molecular hydrogen: The properties of the enzyme.[J]. Biochemical Journal, 1931, 25(1):205. 发现氢化酶² Gaffron H. Reduction of carbon dioxide with molecular hydrogen in green algae[J]. Nature, 1939, 143(1):204-205. 绿藻在“暗反应”中氧化氢气同时固定二氧化碳Gaffron H. The oxyhydrogen reaction in green algae and the reduction of carbon dioxide in the dark. [J]. Science, 1940, 91(2370):529-530. 绿藻在“暗反应”中氧化氢气同时固定二氧化碳Gaffron H, Rubin J. Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae. J Gen Physiol 1942;26:219–40.绿藻在光照下释放氢气Stuart T S，Gaffron H . The Gas Exchange of Hydrogen-adapted Algae as Followed by Mass Spectrometry[J]. Plant physiology, 1972, 50(1):136-140.Boichenko E. Evolution of hydrogen by isolated chloroplasts [J]. Compt. Rend. Acad. Sci. USSR, 1946, 52 521-524. 发现藻类叶绿体产氢，推测高等植物有氢化酶Renwick G M , Giumarro C , Siegel S M . Hydrogen Metabolism in Higher Plants[J]. Plant physiology, 1964, 39(3):303-306. 高等植物种子萌发可以产生氢气² Mal'tsev S V, Krasnovskii A A. Production and consumption of molecular hydrogen by isolated chloroplasts of higher plants [J]. Fiziologiya Rastenii (Moscow), 1982, 29 (5): 951-958. 发现离体豌豆叶绿体能够产生和消耗氢气Xie Y J, Yu M, Lai D W, et al. H2 Enhances Arabidopsis Salt Tolerance by Manipulating ZAT10/12-Mediated Antioxidant Defence and Controlling Sodium Exclusion [J]. Plos One, 2012, 7 (11): e49800. 植物产氢Zeng J, Zhang M, Sun X. Molecular Hydrogen Is Involved in Phytohormone Signaling and Stress Responses in Plants [J]. PloS one, 2013, 8 (8): e71038.植物产氢Jin Q, Zhu K, Cui W, et al. Hydrogen gas acts as a novel bioactive molecule in enhancing plant tolerance to paraquat-induced oxidative stress via the modulation of heme oxygenase-1 signalling system [J]. Plant Cell & Environment, 2013, 36 (5): 956-969.植物产氢Maione T E, Gibbs M. Hydrogenase-Mediated Activities in Isolated Chloroplasts of Chlamydomonas reinhardii [J]. Plant Physiology, 1986, 80 (2): 360-363.Wang Y , H Yang, Zhang X , et al. Microalgal Hydrogen Production[J]. Small Methods, 2020, 4. 微藻产氢综述
