【疫苗简史】新冠疫苗中的佐剂派啥用？斗地主中的超级加倍你听说过吗
全球新冠病毒疫苗接种热火朝天，大家对不同疫苗都进行了比较，主要关心的问题无非是疫苗安全性怎么样？保护效力有多高？对病毒变异株能否依然有效？其中来自Novavax的新冠疫苗（NVx-CoV2373）的临床研究结果引起了大家的关注，在英国进行三期临床试验中期分析结果显示，其在保护人们免受新冠病毒感染方面的有效性为89.3%，并且发生严重和医疗不良事件的发生率较低。不仅如此，他们的疫苗对英国和南非的突变株也分別拥有89.7%和48.6%的有效率。
NVX-CoV2373是一款重组蛋白疫苗，基于基因序列设计，利用重组纳米粒子技术创建的纳米颗粒疫苗，可产生源自冠状病毒刺突（S）蛋白的抗原，并包含Novavax的专利皂甙型Matrix-M佐剂，可增强免疫反应并刺激高水平的中和抗体。
Novavax能达到较高的有效率，跟这个佐剂的使用有直接的关系。那么佐剂究竟是什么东西呢？为什么能够增强疫苗的免疫反应呢？我们今天就来聊聊佐剂的故事。
佐剂好比是烹饪用的调料
佐剂是添加到疫苗抗原中以增强和调节抗原免疫原性的物质。
一般而言，佐剂可用于灭活疫苗，亚单位重组疫苗，这些疫苗的蛋白抗原在纯化过程中会丢失病原体中存在的一些触发免疫反应的免疫学信息。减毒活疫苗由于本身携带必要的免疫刺激信号，因此通常不需要佐剂。
抗原和佐剂是疫苗的两个重要组成部分
如果把制造灭活或者亚单位疫苗比作是在烹饪一道美味佳肴的话，那么，无论是灭活的病毒还是利用基因技术制造的组分蛋白就是这道佳肴使用的食材。
食材的好坏对这道菜最终如何起到了最重要的作用。但是，好的厨师一定知道，一道佳肴的烹饪，同样离不开油盐酱醋这些佐料的辅助。如果离开了这些调味品，再好的食材都不能烹饪出一道令人垂涎三尺的佳肴。
而制造疫苗的调味品就是佐剂，成功的佐剂可以使得疫苗如虎添翼，犹如斗地主一手好牌还叫了一个“超级加倍”。
同时，大家也一定知道，不管是山珍海味，其实调味品也就是油盐酱醋这几样。同样，制造疫苗，不管是针对哪种病原体，选用怎样的抗原，佐剂也就这几种。我们接下来就介绍一下制造疫苗用到的的油盐酱醋。
盐：铝盐
就像绝大多数菜肴在烹调中都会加盐进行调味一样，铝盐是佐剂中最为常见的一款。
在1925年，Ramon观察到，为制造白喉抗毒血清，当给于马接种白喉类毒素的同时给予马以多种物质（包括淀粉，植物提取物或鱼油），可显着增强对类毒素的抗体反应。一年后，Glenny使用硫酸铝钾或明矾也观察到了类似的效果。
此后，以明矾为代表的铝盐被用作许多人类疫苗的佐剂。尽管最初将硫酸铝铝称为明矾，但在疫苗界更常将氢氧化铝和磷酸铝称为明矾。而时至今日，氢氧化铝或磷酸铝形式的其他铝盐是人类疫苗中使用最广泛的佐剂。
关于含铝佐剂增强免疫反应的机制尚未完全弄清，目前相对比较公认的机制有以下几种。
首先是储存库机制理论，假定含铝佐剂和吸附的抗原保留在注射部位，抗原被缓慢释放以刺激抗体的产生。
其次，抗原吸附到含铝佐剂上可将可溶性抗原转化为颗粒形式。抗原递呈细胞通过吞噬作用更有效地吸收颗粒物。因此，保持吸附状态的抗原被带入巨噬细胞和树突状细胞。
最后，明矾本身就可以通过先天免疫受体直接刺激免疫系统，促进强烈的体液免疫反应。
铝盐作为佐剂在所有佐剂疫苗中拥有最长，最大的安全记录，在过去的80年中使用了超过30亿剂疫苗，且具有较高的风险收益率。
尽管在许多疫苗中成功使用明矾，但它尤其在针对细胞内病原体和需要强细胞免疫应答的病原体的使用方面存在局限性。
同时含有氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂的疫苗不应冷冻，冷冻可能会影响含铝佐剂和吸附的抗原。如果怀疑已暴露于冷冻温度下，则不得使用。
油：乳剂
具有广泛用作疫苗佐剂悠久历史的另一种方法是乳剂，乳剂有油包水和水包油两种形式。
油包水乳剂：弗氏佐剂
设计用作疫苗佐剂的最早使用的乳剂是采用矿物油基油包水乳剂，称为弗氏佐剂。油包水乳液有两种形式：完全弗氏佐剂（CFA），其中包含矿物油，乳化剂和灭活的细菌结核分枝杆菌；不完全弗氏佐剂（IFA），其成分与CFA相同没有细菌。
1953年美国曾经使用含有弗氏佐剂的流感疫苗对18,000名新兵进行了大规模的临床研究，由于结果发现在注射部位会出现明显结节，偶尔出现脓肿，疫苗后来被撤回。毒性问题的原因是由不可生物降解的油造成的，因此此后未再用于人类疫苗。
水包油乳剂：MF59和AS03
水包油乳剂佐剂最初是作为油包水乳剂的替代品开发的。较低的粘度使它们更易于注射。在1990年代Chiron公司通过用角鲨烯开发了一系列水包油型乳液。
角鲨烯是一种可生物降解/生物相容性油，因最初从鲨鱼肝油中提取得到，故得名。随后发现鲨鱼卵油及其他鱼中也含有它。角鲨烯是胆固醇生物合成中间体之一，是所有类固醇类物质的生物合成前体，存在于几乎所有的动植物细胞中。
由于鲨鱼肝中含有大量角鲨烯，其一直是被用来制药或保健品的主要来源。正在探索替代来源，例如植物角鲨烯。然而，迄今为止，只有鲨鱼来源的角鲨烯的提取纯度才能用于人用疫苗的生产。
MF59和大多数后来开发的水包油乳液均使用角鲨烯。这些水包油乳液表现出一些佐剂性能。MF59主要用于流感疫苗，因为它可以改善免疫反应并改善与多种流感病毒株的交叉反应性。
MF59是水包油乳剂佐剂的代表
H5N1禽流感偶尔会在人与人之间传播，并且一直被担心这种疾病可能会导致大流行，由于大流行发生时，制造流感疫苗的抗原产能相对有限，当时人们寻找在抗原供应有限的情况下对大部分免疫初次接种的人群进行免疫的方法。
对于H5N1大流行株而言，诱导到相当于季节性流感疫苗水平，发现如果需要机体产生足够的免疫力，使用的抗原剂量和季节性流感中的抗原含量相比，可能需要提高到原来的6倍（90 μg对15 μg）。为此，科学家想到了加入佐剂MF59。结果表明，MF59能够以显着减少的抗原剂量（低至7.5 μg）进行免疫，几乎减少了12倍。
研究发现，当疫苗用于从未感染人群时，水包油乳液佐剂在增强免疫原性和减少大流行性流感疫苗剂量方面非常有效。相反，在健康成年人中，季节性疫苗的佐剂效果就要差得多。这表明这一类佐剂对初次免疫很有用，但不能有效地增强预先存在的免疫反应。
加拿大于2015年初批准了针对儿童人群（6个月至2岁）使用MF59佐剂的季节性流感疫苗（FLUAD Pediatric）。一般而言，老年人已感染季节性流感。然而，免疫衰老导致诱导对常规流感疫苗的足够抗体应答的能力降低。过去十年来，FLUAD是一种含有MF59的季节性流感疫苗，已在许多国家/地区获得许可，已显示出可以增强这一无反应人群的免疫应答。
葛兰素史克公司的专有佐剂AS03也已用于流感疫苗，与MF59相似，可增强免疫反应。AS03的组成包括角鲨烯、α-生育酚和吐温80等主要成分。
生育酚是主要表现出维生素E活性的一类化合物。因为其维生素活性首次在1936年针对大鼠繁殖力因素的实验中被鉴定出来，故被命名为“生育酚”。生育酚（维生素E）已被证明具有抗氧化和免疫刺激特性，已发现对AS03的辅助作用至关重要。吐温80是一种非离子型表面活性剂及乳化剂，在疫苗制造中常常用作为赋形剂。
已对老年人使用AS03水包油乳剂的类似候选疫苗对流感症状的影响进行了测试，表明佐剂疫苗比非佐剂疫苗更具优势。
AF03是另外一种基于角鲨烯油的佐剂，已被赛诺菲巴斯德开发的大流行流感分裂病毒体疫苗Humenza®包括在内。在3至17岁的年龄组中进行的各种临床试验表明，只需接种一次该疫苗即可产生抗H1N1大流行毒株的强血清保护滴度。
AF03与MF59以及AS03不同之处在于没有进行微流体化，而是通过一种称为相转化温度（PIT）乳化过程的方法制备的。
总之，以MF59和AS03为代表的水包油乳剂佐剂，不仅增强了免疫反应并降低了剂量，而且还能够增强疫苗多样性和诱导抗体的亲和力。
酱：TLR激动剂
在整个20世纪的大部分时间里，佐剂的发现和开发都是基于观察和实验，对佐剂作用背后的机理尚无明确的免疫学知识。
随着果蝇中Toll样受体（TLR）家族的发现，这种情况在1996年发生了巨大变化。一年后的1997年，Janeway发现了人类TLR4及其在启动适应性免疫反应中的关键作用之间的联系。
Poltorak及其同事发现TLR4充当脂多糖（LPS）感应受体，此后，LPS或其衍生物作为佐剂的使用，使人们对TLR激动剂分子的作用机理有了深入透彻的了解。
TLR4受体在TLRs中具有诱导两条截然不同的信号传导途径的能力，因此是独一无二的
TLR4激动剂（例如LPS或MPL）的免疫识别是通过血清中LPS结合蛋白从聚集物中提取单体来启动的。虽然长期以来一直知道脂多糖LPS是革兰阴性细菌外膜的主要成分，它是免疫系统的有效刺激剂，但由于其毒性作用，其在佐剂中的使用受到限制。
在1980年代初期，埃德加·里比证实，通过依次进行酸性和碱性水解步骤，可从LPS中获得毒性低得多的分子。通过温和的酸水解得到的分子称为单磷酰脂质A（MPLA），其毒性比LPS低得多。
然后，里比及其同事观察到，如果对该MPLA进行进一步的温和碱水解，则得到的分子MPL的热原性更低，但仍表现出佐剂活性。
2009年，MPL成为美国食品药品监督管理局批准使用的疫苗（抗人乳头瘤病毒的HPV疫苗）中的第一个新型佐剂。
醋：皂苷
南美皂树（Quillaja saponaria）的树皮中的皂苷提取物因其免疫佐剂活性而广为人知。皂苷是一类植物来源的天然产物，由三萜或类固醇核心糖基化而成，并被各种糖单元糖基化，并具有重要的生物学和药理特性。
而这种皂苷提取物被称为Quil-A。皂苷的这种混合物具有不同的佐剂活性和毒性，被发现对于人而言过于具有反应原性，自1970年代以来一直用作兽医疫苗的佐剂。
南美皂树（Quillaja saponaria）
Quil-A皂苷对胆固醇具有极好的亲和力，当与含有胆固醇的膜接触时，它们会形成复合物，从而在膜上形成孔。然而在注射部位，这中皂苷会导致相当大的反应原性。
科学家们利用其对胆固醇的亲和力最终开发出了基于Quil-A皂苷的两种人用佐剂：QS21和ISCOM。
Kensil和他的同事采用了一种降低Quil-A皂苷毒性的方法，从皂苷混合物中分离出一种纯净的成分，称为QS21，其毒性较低，但保留了佐剂活性。QS21已被广泛用作佐剂，以增强对经典全生物疫苗和现代亚单位疫苗的免疫反应。
尽管QS-21在许多疫苗临床试验中具有惊人的功效和前景，但其在稀缺性和异质性，剂量限制性毒性和化学不稳定性方面的固有局限性阻碍了其进一步的临床进展。通过从头化学合成在分子水平上对天然产物进行结构修饰已成为解决这些问题的有效方法。葛兰素史克公司开发的疟疾疫苗（Mosquirix）和带状疱疹疫苗都使用了QS21作为佐剂的重要组成。
免疫刺激复合物（ISCOM）最早开发于1980年代初期。在研发亚单位疫苗的过程中，Morein得出结论，亚单位疫苗的免疫原性不能令人满意，无法在没有其他增强作用的情况下用作疫苗。他尝试通过抗原的多聚体微粒形成来提高免疫原性，但结果并不令人满意，需要额外的免疫刺激。
他选择的佐剂是皂苷或Quil A，因为这些分子（如提取的纯化的病毒膜蛋白）是两亲性的，并在水溶液中形成胶束。目标是结合胶束，由抗原和佐剂组成的多聚体颗粒。所得产品没有蛋白质胶束预期的物理特性，沉降系数较低，并且通过负染色电子显微镜观察到非常特殊的规则外观。由于其强大的免疫原性，该产品被称为ISCOM。
在接下来的几年中，ISCOM被证明优于大多数其他竞争性佐剂制剂。配制到ISCOM中的抗原不仅会诱导高强度和持久的抗体反应，而且这些抗体在生物学上也更具活性。除抗体反应外，还证实了包括CTL在内的强列的细胞反应。
使用ISCOM进行强力免疫刺激所需的抗原数量出奇地低；因此，在大流行性流感感染的威胁要求潜在佐剂具有这种特征之前，就已经证明了节省剂量的作用。
ISCOM技术已成为包含“经典” ISCOM的统称，它是由Quil-A的部分纯化的皂苷，胆固醇和磷脂以及物理结合到结构中的抗原组成的40 nm复合物，以及其他基于皂素的颗粒状开发物，例如ISCOM-Matrix不含物理整合到复合物中的抗原。
基质与抗原的简单混合物可以构成有效的佐剂，通常与经典的ISCOM一样有效，因为ISCOM的核心佐剂作用被认为依赖于佐剂和佐剂的共同存在。用基质佐剂配制疫苗很方便，因为只需将疫苗抗原与基质颗粒在不需要吸收或乳化作用的生理缓冲液中的悬浮液混合即可。
由于实际原因，Matrix制剂成为ISCOM技术衍生的人和动物疫苗开发的首选佐剂。经典的ISCOM技术的主要问题是可复制的抗原掺入。控制掺入率和最终组成的方法很费力且昂贵，而基质可以大批量生产，然后再与抗原混合。
新一代佐剂：Matrix-M
而此次Novavax公司生产的新冠病毒疫苗NVX CoV2373含有的佐剂Matrix-M，正是一种新型的ISCOM，含有皂苷和胆固醇混合物的佐剂。Matrix-M佐剂技术的发展始于皂苷组分的纯化和性质鉴定。
可以看到从ISCOM到Matrix-M，技术经过了逐步净化
在Matrix-M中，将纯化的皂苷级分与合成胆固醇和磷脂混合以形成稳定的颗粒，然后可以很容易地用多种疫苗抗原配制这些颗粒。基于皂苷的佐剂部分地通过刺激抗原呈递细胞进入注射部位并增强局部淋巴结中的抗原呈递而起作用。因此，Matrix-M既可以诱导细胞介导的免疫反应，也可以诱导抗体介导的免疫反应。
Matrix-M还增加了持续时间更长的免疫反应的机会，这可以减少获得最佳保护所需的疫苗接种数量。临床前研究表明，与早期制剂相比，Matrix-M不但有效佐剂活性显著增强，并且安全性也更好。
Matrix-M 佐剂能够显著加强免疫原性。对比不添加佐剂组，接种添加 Matrix-M 疫苗的受试者，其体内的中和抗体水平是未添加佐剂组的 81 倍。NVX-CoV2373是目前中和抗体最高值唯一超过1000（达到3906）的疫苗。
除了新冠疫苗之外，Matrix-M在抗寄生虫疫苗的研发中也崭露头角。就在前不久，牛津大学Mehreen研究团队在《柳叶刀》杂志在线发表了评估疟疾候选疫苗R21的2b期临床试验的结果。结果显示该疫苗的有效率为77％。这大大高于迄今为止最有效的疟疾疫苗RTS，S / AS01疫苗的保护效力。
在非洲儿童中，RTS，S / AS01疫苗在12个月内的有效率仅为55.8％。而这种R21疟疾候选疫苗的佐剂同样也是来自Novavax的佐剂Matrix-M。也就是说，Matrix-M佐剂很可能明显增强了疟疾疫苗的免疫反应，使得疟疾疫苗有了突破性进展。
一种成功的新型佐剂可以是不同成分的组合
上述的“油盐酱醋”成为现代人用疫苗的基础组成佐剂成分，然而，就像调料在烹调不同风味的佳肴中需要不同的组合和配比一样，科学家们针对上述佐剂在不同的疫苗设计中中，也是按需取用，采用不同的组合和配方。
例如，TLR4激动剂MPL与铝盐结合使用，两种佐剂的结合称为AS04。利用这种佐剂，科学家们制造出了HPV疫苗Cervarix 和血液透析患者的乙型肝炎疫苗Fendrix。
而佐剂系统AS02由AS03乳剂组成，并掺入了免疫增强剂QS-21和MPL以诱导强抗体和细胞免疫应答。
TLR4激动剂MPL与皂苷提取物QS21以及胆固醇结合，可以进一步增强佐剂活性，并且其开发者葛兰素史克公司将所得的佐剂组合称为AS01。使用AS01B佐剂的带状疱疹带状疱疹疫苗的功效> 96％。AS01同样是上文已经提到的目前唯一一款获批疟疾疫苗RTS，S / AS01疫苗的佐剂成分。
小结
总之，佐剂的存在，就好比在斗地主游戏中叫到了一个超级加倍，从而使得我们的疫苗：
在未感染的人群中提供强大的启动反应，有效减少诱导保护所需的剂量数量。
增加免疫反应的持续时间。
增强免疫应答的特定功能，例如细胞介导的免疫，这也是许多我们尚未开发出理想疫苗的传染病的关键目标。
增加对可变抗原的免疫反应的广度，从而实现更广泛的交叉保护。
在反应较差的人群（如老年人和免疫抑制人群）中增强免疫应答。
在抗原供应有限的情况下，可以节省抗原剂量。
当然，就像烹饪中调料不应该是唯一的主角一样，疫苗是基于抗原和佐剂的组合构建的，仅强大的佐剂无法产生所需的免疫反应。就好像即便你在欢乐斗地主中叫到了超级加倍，如果手里没有好牌还是徒劳。
因此不应忽视对相关抗原和免疫原性抗原的需求。由于越来越多的疫苗将需要诱导体液免疫和细胞介导免疫的双重作用，因此需要研究人员寻求改善抗原的固有免疫原性，并在需要添加佐剂的情况下确保最佳的免疫反应。
既不是油盐酱醋放得越多，就能使得一碗普通的菜成为佳肴，也不是每种菜品都需要添加全“油盐酱醋”这四种调料才称为佳肴。成为佳肴的条件是需要有好的食材，好的调料配比和好的厨师。对于灭活或者是亚单位蛋白疫苗的制造来说，选用具有良好抗原表位的抗原，合适的佐剂是成功的重要保证，两者缺一不可。
只有根据针对的疾病，相关的保护性免疫应答和目标人群选择合适的抗原和佐剂组合，佐剂才能兑现其诺言，成为增进人类健康的有效工具。
参考文献
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