TR | 日常环境监控(EM)培养基和培养温度选择 20-25℃ or 30-35℃

培养条件讨论 Discussion regarding to incubation conditions

环境监控（EM）是药品生产操作微生物质量控制系统不可分割的一部分。环境监控微生物采样可确认生产洁净区的微生物质量是否处于受控状态。因此，现有几个无菌生产工业指南均强调了建立合理的环境监控程序的重要性。不过，这些指南除了在强调环境微生物监控的重要性上保持了一致外，就具体的环境监控程序上的建议却存在很大差异。尤其对于培养时间、培养温度或者所用的培养基，无论是内容，还是详细程度，均不一致。

美国食品药品监督管理局（FDA）无菌药品生产指南建议说“环境监控用培养基在合适的培养时间和温度条件下对真菌（酵母菌和霉菌）以及细菌的回收能力应符合规定”。总需氧细菌可在30–35°C条件下培养48~72小时。总酵母菌和霉菌可在20 –25 °C条件下培养5~7天。

USP<1116> 对培养时间和培养温度介绍的较少，但对使用什么样的培养基介绍的更详细些。而且，认为环境微生物采样也可以只用一种培养基（TSA），采用两种培养温度，即高温段和低温段，以更好的回收细菌和真菌。并建议“通用的培养基比如大豆酪蛋白消化物培养基（SCDM）适用于绝大多数情况下的环境监控，因为它既能支持广谱的细菌生长，也能支持广谱的酵母菌和霉菌生长。如有必要可以采用沙氏、改良沙氏或加了抑菌剂的霉菌琼脂培养基进行采样。一般来说，对于通用型的培养基如SCDM，采用的培养温度可在约20–35°C范围内，培养时间不少于72小时。如果环境微生物可能生长缓慢，也可以考虑延长培养时间。在没有确凿证据的情况下，微生物实验员可以考虑采用一种培养基，选用低温和高温双温度段培养。但先低温培养可能对和人员密切相关的革兰阳性球菌的回收有危害”。

ISO-14698-102003 clean rooms and associated controlled environments bio-contaminants control里仅仅介绍了培养时间，而没有提及相关的培养温度和所用培养基。

EU GMP 附录1对环境监控培养条件没有任何建议。而且，PDA技术报告13，这份工业最佳指南性质的文件对于环境微生物监控采用什么样的培养基及培养条件也没有具体建议。

PDA于2014年发布的文章“环境监控微生物样品不同培养条件对比研究”介绍说，哪怕后续会在20 –25 °C培养，只要先在30 –35 °C条件下培养，就会对霉菌生长严重不利，这和USP<1116>认为两个温度段先高温段培养更有优越性矛盾。数据表明，使用一种广谱培养基（比如TSA），无论是在两个温度段先20 –25 °C培养，还是在中间温度范围25–30 °C都能得到合适的回收率。霉菌回收和培养温度反相关。有意思的是，高温段培养后，随后的低温培养对于霉菌的回收也没有补益。

PDA于2014年发布的文章“环境监控微生物样品不同培养条件对比研究”还介绍说，使用两种培养基做环境监控不是最佳实践。比如，对于无菌生产来说，相对于采用一种培养基，使用两种培养基做环境监控会使干预的周期及动作大大增加，对产品无菌保障风险也相应增加。当然，这种风险对于隔离器或者RABs设备会小很多。另外，控制良好的ISO 5/7级别的洁净区中，人来源的微生物是最常见的污染源，其中真菌比例一般约为1%。因此，虽然认为使用两种培养基会使真菌回收率略微上升，但相对于可能加大的产品污染风险，使用两种培养基做环境监控不是最佳实践。

PDA在2017年对全球无菌制剂生产厂家进行一次调查，结果显示61%的厂家采用一种培养基TSA采样，先20-25℃后30-35℃的培养，不过也有26%的厂家采用30-35℃培养，约13%的厂家采用其他的培养方式。

综上所述，根据最近官方审计意见，理论上平皿培养最佳条件，对各指南中间差异的重新考量，环境监控可使用一种广谱培养基（比如TSA），采用两个温度培养，先20–25 °C培养，然后30–35 °C 培养。

文章来源：朱老师提供