Cell丨线粒体的“守门员”——感知还原应激，维护细胞氧化还原平衡

多细胞生物产生成年有机体所需的200多种细胞类型的发育过程依赖于体内精细的平衡系统，这其中非常重要的一部分包括一系列氧化还原反应，用以产生能量（如ATP），并从营养物质中合成必要的细胞成分（如核酸），以支持各种生物学功能的发生。在氧化还原反应中，电子从还原剂流向氧化剂，体内含有多对氧化还原对可作为酶中和或非酶中和ROS的辅因子或底物，以维持细胞中相对还原的环境。细胞内氧化还原反应的失衡是由氧化剂和抗氧化剂之间的平衡紊乱引起的，是多种病理生理过程的标志性事件【1,2】。

干细胞作为承担分化发育及组织修复的重要细胞，无疑是处于体内平衡这一复杂程序顶端的一类细胞。为了保护干细胞群不受损害，生物体拥有保守的应激反应途径，可用于检测和缓解各种不利条件，一旦失衡则必将导致许多先天疾病、肿瘤发生和组织退化等【3】。正常情况下，许多干细胞处于低氧环境中，以糖酵解作为主要的能量来源，从而限制了DNA、脂质或蛋白质的氧化损伤。当过多的活性氧自由基（ROS）积累时，这些细胞将激活氧化应激反应，使转录因子NRF2稳定，驱动清除氧化分子的蛋白质的表达，并将氧化蛋白还原为功能性还原状态【4】。倘若此时细胞未能成功诱发抗氧化信号，将损害干细胞的自我更新和分化，并危机组织的维持，或破坏干细胞的完整性【5,6】。研究已经证实，应激反应通常由泛素化所控制，当细胞经历氧化应激时，KEAP1蛋白与Cullin-3（CUL3）和RBX1配对形成的E3 CUL3KEAP1被抑制，而原本被其泛素化抑制的NRF2则在细胞核中积累，驱动抗氧化基因的表达【7】。

然而，此时此刻，如果你以为只要能保证细胞快速激活氧化应激就万事大吉的话，那就把生物体想的太简单了。与应激反应的快速激活同样重要的，就是在细胞内稳态恢复后应激反应的及时关闭。持续的氧化应激反应将使干细胞不能积累信号转导所需量的生理性ROS，这也将导致其不能进行分化。持续缺乏ROS，则还原应激发生，会阻碍胰岛素信号转导和葡萄糖稳态，引发心肌病、肥胖或糖尿病，并增加死亡率【8,9】。显而易见，还原应激与氧化应激一样重要，体内氧化还原反应的天平偏向任何一方都将造成大分子氧化损伤和细胞功能紊乱。然而，目前对于两者的研究的天平明显偏向氧化应激，我们对于细胞是如何感知还原应激、如何使其减缓的仍然未知，还原应激是否如氧化应激一样受到泛素依赖的应激反应的控制，以及是否与干细胞发育有着重要联系也都一概未知。

近日，来自美国加州大学的Michael Rape研究团队在Cell 上在线发表题为“A Cellular Mechanism to Detect and Alleviate Reductive Stress”的文章，证明细胞内线粒体失活、ROS持续降低可引发还原应激反应，从而诱导蛋白酶体降解机制，进而加速细胞代谢以保障氧化还原稳态和干细胞的完整性。同时利用成肌细胞分化确认了E3泛素连接酶CUL2FEM1B及其底物FNIP1是还原应激反应发生的核心成分，由此填补了人们对还原应激发生机制理解的空白。

作为一个依赖氧气的组织，肌肉拥有一套能识别与氧化还原应激相关蛋白质的体系，那么Cullin-Ring-E3连接酶（CRL，可调控应激和发育信号的E3家族）在体外肌生成过程中扮演着什么样的角色呢？本文研究人员发现，CUL3配体KEAP1、BTBD9、KLHL22和ANKFY1对于肌管的形成是必需的，而CUL2配体FEM1B的缺失则极大地促进了这一分化过程。值得注意的是，研究发现成肌细胞中KEAP1的缺失在较长时间内均诱导了NRF2及其靶点的积累，导致NADPH水平的增加和ROS的急剧下降，标志着还原应激的发生，最终抑制成肌细胞的分化。由此表明还原应激可以在体外损伤肌生成过程。

随后，为了剖析细胞对还原应激的应答，研究人员设计了一个旨在挽救KEAP1缺陷成肌细胞分化的基因修饰筛选系统。结果发现CUL2配体FEM1B可以显著影响由KEAP1缺陷或线粒体来源的ROS所产生的还原应激。FEM1B的缺失使KEAP1缺陷成肌细胞中NRF2及其靶点的表达减少，NRF2由核内转移到核周区域，从而无法诱导相关基因的表达，ROS水平恢复，同时肌生成相关基因表达增加，肌管生成得以恢复。

进一步的实验发现，FEM1B可以与GATOR1、FLCN和FNIP1相互作用，值得注意的是，当FEM1B过表达时，可诱导依赖于CUL2和蛋白酶体的FNIP1的降解。虽然FNIP1本身对细胞分化没有明显影响，但是在FEM1B缺失时，FNIP1的积累可促进分化，而此时FNIP1的缺失将抑制肌生成，促使NRF2重新进入细胞核（图1）。由此表明，FNIP1是E3连接酶CUL2FEM1B参与还原应激过程的一个关键靶点，而CUL2FEM1B对这个重要底物的识别依赖于对FNIP1降解决定子上的未经修饰的Cys残基的识别。当还原应激发生时，FNIP1降解决定子上的Cys残基的氧化被逆转，从而促进了CUL2FEM1B与其的结合。可以说FNIP1降解决定子是一个可由CUL2FEM1B识别的还原应激传感器。当通过CUL2FEM1B降解FNIP1时，可增加细胞内几种代谢物的可用性，从而可能提供一种启动三羧酸循环并诱导线粒体来源的ROS产生的方式，细胞线粒体功能被激活，进而抵消还原应激。由此表明CUL2FEM1B和FNIP1不仅可以感知细胞还原应激的发生，还能因此减缓还原应激反应，是还原应激的核心组分。

图1

综上所述，本研究确定了CUL2FEM1B及其靶点FNIP1为还原应激反应的核心组成部分，而只有当还原应激发生期间（由持续的抗氧化信号或线粒体失活所引起）FNIP1的Cys残基的氧化被恢复时，CUL2FEM1B才会与FNIP1结合，使其被泛素化降解，进而激活线粒体来抵消还原应激反应（图2）。FNIP1犹如线粒体的守门员，CUL2FEM1B与FNIP1则完美配合，构成了一个依赖于泛素化的应激组合，通过对FNIP1的降解或稳定的控制来调节线粒体ROS的产生，维持着氧化还原反应的平衡，满足成肌细胞代谢和氧化还原的需求。

图2

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.034

制版人：MENG

参考文献

1. Wei-Xing Ma, Chun-Yan Li et al. Reductive Stress-Induced Mitochondrial Dysfunction and Cardiomyopathy. Oxid Med Cell Longev. 2020; 2020: 5136957.

2. Xiao W, Loscalzo J. Metabolic Responses to Reductive Stress. Antioxid Redox Signal. 2020; 32(18):1330-1347.

3. Avior, Y., Sagi, I., and Benvenisty, N. (2016). Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 170–182.

4. Suzuki, T., and Yamamoto, M. (2017). Stress-sensing mechanisms and the physiological roles of the Keap1-Nrf2 system during cellular stress. J. Biol.Chem. 292, 16817–16824.

5. Tsai, J.J., Dudakov, J.A., Takahashi, K., Shieh, J.H., Velardi, E., Holland, et al. (2013). Nrf2 regulates haematopoietic stem cell function. Nat. Cell Biol. 15, 309–316.

6. Vilchez, D., Simic, M.S., and Dillin, A. (2014). Proteostasis and aging of stem cells. Trends Cell Biol. 24, 161–170.

7. Zhang, D.D., Lo, S.C., Cross, J.V., Templeton, D.J., and Hannink, M. (2004). Keap1 is a redox-regulated substrate adaptor protein for a Cul3-dependent ubiquitin ligase complex. Mol. Cell. Biol. 24, 10941–10953.

8. Bellezza, I., Giambanco, I., Minelli, A., and Donato, R. (2018). Nrf2-Keap1 signaling in oxidative and reductive stress. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 1865, 721–733.

9. Bjelakovic, G., Nikolova, D., Gluud, L.L., Simonetti, R.G., and Gluud, C. (2007). Mortality in randomized trials of antioxidant supplements for primary and secondary prevention: systematic review and meta-analysis. JAMA 297, 842–857.