5分+m6a调控RNA甲基化纯生信，这么多m6a文章中看起来相对靠谱的分析
表观遗传畸变在肝细胞癌（HCC）的发生和发展中起着重要作用，但目前尚不清楚N6-甲基腺苷（m6A）修饰相关基因表达的变化及其在肝癌进展中的作用。在本研究中，作者全面分析了605个HCC样品的m6A调节修饰模式，并将其与代谢改变特征相关联，阐明了390个基于HCC基因的m6A相关签名，并定义了一个m6A score来量化m6A修饰。最后评估了它们的价值以预测HCC患者的预后和治疗反应。
发表杂志：Cancer Biol Med.
影响因子：5.57
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研究背景
肝细胞癌（HCC）是一种高度恶性肿瘤，具有复发率高，耐药性高和预后差等特点。在癌症的发展进程中会发生许多生物学上的改变，称为癌症标志，包括但不限于代谢，免疫原性和增生性改变。已有研究表明，m6A调控的异常修饰模式与多种癌症的特征相关，例如上皮间质转化（EMT），侵袭，转移和耐药性等。值得注意的是，m6A修饰可以调节肿瘤微环境（TME），并且确定对PD-1抗体的反应中起决定性作用。而且，在HCC中报道的m6A调控模式显示，m6A相关基因（包括YTHDF2，WATP，KIAA1429和YTHDF1）的调节异常会促进HCC的生长和进展。
分析解读
1. HCC数据下载和预处理
①从TCGA、GEO、和ICGC数据库收集基因表达数据、拷贝数变异数据、DNA甲基化数据和临床数据。
②筛选了4个队列：TCGA-LIHC（369个样本）、ICGC-LIRI-JP（225个样本），GSE14520（221个样本）和GSE109221（67个样本）。
2. HCC中m6A调节因子的遗传变异情况分析
①从PubMed中挖掘到23个m6A调节因子，并确定了与HCC相关的13个m6A调节因子，包括WTAP、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、FTO、KIAA1429、YTHDF1、METTL3、METTL14、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC2和HNRNPA2B1。
②从TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP队列合并的元队列中进行聚类。
③R包“Nbcluster”用于确定最佳群集数，其最小值为：min.nc=2，max.nc=15，方法为“kmeans”
④使用R包“Kmeans”执行K-means聚类，并确定聚类：centers=3，nstart=25。
结果显示：
①与非肿瘤肝组织相比，肿瘤组织中m6A调节因子的调节显著上升。
②PCA分析证实肿瘤和非肿瘤肝组织之间m6A调节表达模式既有明显异质性（下图A，D)。
③对拷贝编号变异（CNV）调查显示，CNV在m6A调节因子中普遍存在变化（下图B)。
④甲基化数据分析揭示了大多数m6A调节因子的低甲基化状态，这可能与m6A调节因子过度表达相关（下图C)。
⑤m6A调节因子的表达模式彼此高度相关（下图E）。
⑥COX回归模型分析表明，大多数m6A调节因子是预测较差的风险因素（METTL14、ZC3H13、YTHDC2和FMR1除外）。
⑦357个TCGA-LIHC队列样本中只有41个基因突变，其中变化最大的m6A调节基因是KIAA1429，比例为1%（下图F)。
3. HCC中的m6A甲基化修饰模式
①由TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP队列的605个样本组成元队列，在集群过程中仅包含20个m6A调节因子（删除了IGF2BP家族）。
②经过k均值聚类后，确定了3个具有不同m6A表达模式的聚类，即m6Aclusters C1-C3（下图A）。
③m6A调节因子的表达水平在群集之间变化（下图B）。
④基于GO-BP中的mRNA甲基化基因特征计算了3个簇的GSVA富集得分，以评估m6A调节剂表达模式如何影响mRNA甲基化。
⑤簇C1和C3分别具有最低和最高的mRNA甲基化富集得分（下图C），这证实了m6Acluster中m6A调节子表达水平的差异影响了mRNA甲基化水平。
⑥PCA分析显示了证实了这3种模式的存在的鲁棒性（下图D）
⑦确定m6A表达模式如何影响预后。结果发现3个组中的患者的总生存期（OS）不同。与C3组相比，C1和C2组的患者预后相对较好（下图E）。
4. HCC中的m6A甲基化的代谢表征差异
①使用MsigDB基因集进行GSVA富集分析。
②计算簇之间的差异表达基因（DEG），并在功能上对其进行了注释。
③比较了m6Acluster之间代谢相关基因集的GSVA富集得分。
④根据从GO、KEGG和BIOCARTA基因特征中挖掘出的50种代谢相关生物过程的GSVA富集分数对HCC样本进行分层聚类。
结果表明：
①簇C1和C2在代谢过程中活跃，簇C3富含甲基化、细胞周期调节和增殖过程（下图A，B）。
②聚类C1，C2和C3之间的DEG的KEGG注释显示出相似的结果（下图C）。
③GSVA富集得分显示：簇C1在碳水化合物，脂质和氨基酸代谢中活跃，而簇C3表现为低活性代谢（下图DEF）。
④识别了HCC中具有不同代谢模式的3个聚类（下图A）。
⑤比较3个簇中每个主要代谢过程的距离，发现脂质代谢改变最强（下图B）。
⑥LMH集群具有最低m6A调节因子表达水平和最低甲基化富集分数（下图C，D）。
⑦m6A甲基化与代谢活性之间呈负相关，预后分析显示LML患者的OS较差（下图E）。
5. m6A基因签名和m6Ascores的定义
①在3个m6A簇中识别出DEG，利用单变量COX回归分析筛选到390个基因作为m6A签名基因。
②将所有的m6A签名基因在-1至1之间归一化，并计算HR＞1的m6A签名基因的总和与HR＜1的m6A签名基因的总和之差作为m6Ascore。
③在GOBP数据库中计算了m6Ascore与7,980个生物学过程的GSVA富集得分之间的皮尔森相关性。
结果显示：
①m6A基因签名反映了m6A簇之间的差异，m6A score与mRNA甲基化富集得分高度相关（下图A）。
②与m6Ascore具有最高相关性的排除的与mRNA相关的生物学过程如下图B所示。
③结果表明，代谢过程与m6A score呈强负相关（下图BC），而与细胞周期相关的过程呈正相关（下图B）。
④m6A调节基因在两个m6A簇中的表达差异（下图E）。
⑤GSVA在两个m6A score集群中浓缩mRNA甲基化分数（下图F）。
6. HCC中m6A调节因子修饰模式簇与其他分子分层之间的联系
①使用m6A score中间值作为截止点，将HCC样本分为m6Ascore高集群和m6Ascore低聚类，并构建了冲积图。
②进一步确定了m6Ascore在预测患者结果方面的价值，以调查m6Ascore与临床人口统计学之间的联系。
③在元队列中应用了生存分析，并在微阵列衍生队列中进行了验证。
④测试了m6Ascore是否可以用作HCC的独立预后生物标志物。多变量COX回归模型，包括年龄、m6Ascore和阶段确认m6Ascore是评估患者结果的强大和独立的预测标记。
⑤构建了将m6Ascore（高与低）、阶段和年龄集成图。
⑥检查了m6Ascore预测索拉芬尼治疗疗效的能力。
结果表明：
①与m6Ascore高患者相比，在训练队列和独立验证队列（GSE14520）中，m6Ascore低患者均具有更好的OS（下图A，B）。
②构建了一个包含m6Ascore（高vs.低），阶段和年龄的列线图（下图C）。
③预测元队列的1年，3年和5年OS的AUC值分别为0.71、0.69和0.70，而在GSE14520中，它们的AUC值分别为0.74、0.75和0.71（下图DE）。
④除存活率外，其他临床特征的比较显示，m6Ascore高组的患者较年轻且具有较高的分期（T期和TNM期）（下图FGH）。
⑤与m6Ascore高患者相比，m6Ascore低患者显示出对索拉非尼更高的反应率（下图IJ）。
小结：
在本研究中，作者通过关注20种m6A调节因子，在肝癌中定义了3种不同的m6A修饰模式，这些模式与不同的代谢状态相关。簇C1包括最低表达的m6A调节剂和最低的mRNA甲基化水平，并与最高的代谢活性相关。簇C2与中间表达的m6A调节剂和中间mRNA甲基化相关，并与中等代谢活性相关。簇C3与m6A调节剂的最高表达水平和最高的mRNA甲基化相关，并且与最低的代谢活性相关。在所有主要的代谢类别中，脂质代谢在HCC中是最不均匀的，并且与m6Ascore具有最强的相关性，这表明脂质代谢是HCC中m6A调节剂最可能的靶标。预后分析显示，C1患者的OS最长，而C3患者的OS最短，这与先前的研究发现脂代谢活跃的HCC患者的预后更好，肿瘤等级更低。而且作者还确定了m6Ascore在预测患者对索拉芬尼疗法的反应方面的价值。在STORM组中，与低m6Ascore患者相比，高m6Ascore患者对索拉芬尼治疗的反应更强。此发现为m6A调节剂在调节生物学过程和影响HCC代谢异质性中的作用提供了新的见解。