JEV：细胞外囊泡治疗剂的无标记表征，可区分EV与非囊泡颗粒

在过去十年中，人们对细胞外囊泡(EV)作为治疗剂的兴趣急剧增加。目前对基于EV的疗法进行表征和质量控制的方法包括粒子追踪技术、蛋白质印迹和先进的流式细胞术，但缺乏标准化的方法。该研究建立并验证了石英晶体微量天平(QCM)作为一种高灵敏度的无标记免疫传感技术，用于表征细胞外囊泡。该方法能够定量确定标记特异性EV与非囊泡颗粒(NVP)的比率——这是迄今为止任何其他技术都无法获得的参数。这种测量模式可以识别EV亚组分，区分EV和NVP，并表征EV表面蛋白，且只需要少量的样品，为改进细胞外囊泡制备的质量控制打开了大门。

在过去十年中，人们对用于治疗用途或作为医疗产品的细胞外囊泡 (EV) 的兴趣大大增加。EV是被膜包围的颗粒，可能由所有真核细胞类型自然释放。外泌体或小型EV的大小范围为30-150 nm，并携带细胞类型特异性蛋白质、脂质以及编码和非编码核糖核酸。它们与细胞信号传导有关，以调节免疫和再生等生物过程，但也在癌症、感染和退行性疾病（如神经退行性疾病）中发挥病理生理作用。

从多能间充质干细胞 (MSC) 中获得的EV对治疗用途特别感兴趣，因为它们具有抗炎和抗凋亡作用，刺激血管生成和伤口愈合。当前的一项临床研究调查了使用MSC-EV治疗I型糖尿病(NCT02138331)。在个体治疗尝试中，MSC-EVs被用于移植物抗宿主病患者。由于可变的细胞分泌组，基于EV的治疗剂（自然过程的产物）的特性波动很大。此外，可产生的EV的数量和组成受细胞培养和扩增条件以及EV收获和分离技术的影响。从细胞分泌组中，可以富集混合的EVs群，例如外泌体、微囊泡、脱落囊泡（ectosomes）和微粒，以及许多可溶性因子，所有这些都参与细胞间通讯。

尽管EV于2005年首次用于患者的癌症治疗，但仍然没有常规建立的标准技术用于临床生产的EV疗法的质量控制。细胞外囊泡研究指南的最新最低限度信息(MISEV)指出，定量和单粒子表征应通过包括但不限于粒子追踪技术的大小和计数、电子显微镜成像和先进的流式细胞术进行。当前的粒子定量方法，例如纳米粒子跟踪分析 (NTA)、动态光散射 (DLS) 和电阻脉冲传感 (RPS)，无法将EV与其他粒子区分开来。拉曼光谱能够确定EV制剂在纯度和组成（蛋白质与脂质和核酸与脂质的比率）方面的差异，但该技术不适用于基于沉淀或密度的商业试剂盒生成的EV制剂梯度纯化。此外，使用同步瑞利和拉曼散射以及激光镊子拉曼光谱，可以通过分子组成区分来自不同细胞来源的单个或至少少量 EV。

然而，各种EV组分的叠加使数据解释复杂化，完整的定量表征方案开发仍在进行中。双波长表面等离子体共振 (SPR) 提供有关纳米粒子的浓度和大小或特征表面蛋白质的存在的信息，但无法区分EV和其他粒子（例如蛋白质聚集体），这些粒子可能在分离过程中被共富集。由于异质性和尺寸小，EV表征仍然具有挑战性。

原子力显微镜 (AFM) 成像可用于表征EV分离程序对EV尺寸分布、形态和机械性能的影响。有研究结合傅里叶变换红外光谱、紫外共振拉曼光谱、AFM和小角度X射线散射分析EV，以解决EV的尺寸、稳定性和纯度问题。一种更先进的测量粒子数的方法将SPR与AFM相结合。后者提出了一个有希望的第一个策略，以获取有关EV特性的更详细信息。然而，以稳健、可访问和经济的方式确保计数的粒子确实是EVs并且这些EVs具有治疗活性（例如，如其表面标记特征和有意义的生化或基于细胞的测定所示）仍未解决。

石英晶体微量天平 (QCM) 是一种高度灵敏的方法，能够同时检测生物标志物的关联以及由此产生的结合界面机械性能的变化。QCM提供高度灵敏的质量传感，基于通过镀金石英晶体振荡变化的压电效应。它是用于检测和表征表面吸附过程的公认方法。根据Sauerbrey方程，给定薄而刚性的吸附层，频率的变化与质量的变化直接相关。柔软且耗散性更强的吸附层，例如以生物结合过程为代表的吸附层，通常需要更复杂的建模。配体-受体或抗原-抗体的特定相互作用以及超分子系统的行为，例如囊泡和脂质体的粘附，可以以小于1 ng/cm²的灵敏度实时检测，以确定动力学速率和亲和常数。在石英晶体-吸附质系统振荡期间同时检测能量损失允许实验访问不会改变系统质量但会影响其耗散特性的界面变化。它能够区分刚性和软吸附质，并且使用最先进的QCM-D设备之前已被用于以天然浓度对外泌体进行表型亚型区分。

该研究提出了一种基于QCM-I和AFM的方法，以根据其弹性和表面标记来表征EV，并将它们与具有相同表面标记的NVPs区分开来，该方法被定制为稳健、可重复且易于集成到现有实验室基础设施中。

用于表征EV表面蛋白的QCM工作流程

该研究建立并验证了石英晶体微量天平(QCM)作为一种高灵敏度的无标记免疫传感技术，用于表征临床批准的通过切向流过滤和超速离心富集的脐带MSC-EV。将QCM与常见的表征方法结合使用，能够通过EV（CD9、CD63、CD81）和MSC（CD44、CD49e、CD73）标记专门检测EV。此外，QCM耗散与频率的分析使我们能够定量确定标记特异性EV与非囊泡颗粒(NVP)的比率——这是迄今为止任何其他技术都无法获得的参数。此外，通过原子力显微镜(AFM)表征了这些EV的形貌和弹性，使我们能够区分EV制剂中的EV和NVP。这种测量模式可以识别EV亚组分，区分EV和NVP，并表征EV表面蛋白，所有这些都需要最少的样品制备，并使用无标签测量设备，为希望扩大其表征方法的实验室提供低进入门槛表征技术。研究将QCM与阻抗测量(QCM-I)和AFM测量相结合，提供了一种强大的多标记方法来表征临床批准的EV疗法，并为改进质量控制打开了大门。

CD9、CD44、CD49e、CD63、CD73和CD81阳性原代UC-MSC EV制剂的QCM分析

参考文献：Priglinger E, Strasser J, Buchroithner B, Weber F, Wolbank S, Auer D, Grasmann E, Arzt C, Sivun D, Grillari J, Jacak J, Preiner J, Gimona M. Label-free characterization of an extracellular vesicle-based therapeutic. J Extracell Vesicles. 2021 Oct;10(12):e12156. doi: 10.1002/jev2.12156. PMID: 34669269.

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