线性双链DNA型同源重组载体是什么？

该载体依据Red重组系统。线性载体直接利用PCR的方法获得带有与靶基因同源的DNA片段和抗性基因，在Red重组系统的辅助下实现大肠杆菌的无痕敲除。相比于质粒型载体，该方法可以避免目标基因突变体（如基因点突变、基因缺失突变、基因插入突变）克隆和质粒载体的构建，简化了流程。但是该方法有一个缺点，即线性DNA容易被RecBCD酶降解。但这个问题可以被克服，Red重组系统设计时就已经包含了能抑制RecBCD对线性DNA降解的Gam蛋白。该载体同样适用于RecA重组系统。

图1. 应用线性双链DNA型同源重组载体的无痕敲除技术原理图（Fehér等2008）

下图是葛高顺等人改进的大肠杆菌无痕敲除策略，第一步是采用两次PCR扩增出与目的基因两端同源并包含核酸内切酶I-SceI序列的氯霉素抗性片段。然后诱导质粒pKD46表达Red同源重组系统，并进行同源交换敲除目的基因，第二步进行无痕化处理。

图2. 质粒型无痕化基因敲除策略（葛高顺等2014）。