2021技术展望：单物镜光片显微镜

容积成像技术（volumetric imaging）的发展驱动了单物镜光片荧光显微镜的创新。

随着微观生命科学研究的深入，科学家们对显微成像系统的追求也越来越高，导致光学显微镜领域在短短数十年里快速突破。

实验室最常使用的宽场荧光显微镜（widefield fluorescence mrcoscopy）可追溯到1904年。它仅能对事先切好的样品进行成像，不具备光学切片能力，通过物镜将激发光聚焦，收集样品发出的荧光信号。缺点是光毒性较强，信号受到干扰分辨率较低，数据读取速度相对较慢，快速动力学研究捉襟见肘。

20世纪80年代中期发展起来的激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy）是目前使用最广的光学切片技术，虽然成像质量大大优于宽场荧光显微镜，但成像速度慢和光毒性问题依然存在。于是1990年第一台双光子荧光显微镜（two-photon laser scanning microscopy）问世了，与单光子相比，双光子荧光显微成像的光毒性较小，分辨率高，但信号采集速度进一步变慢了。

需要兼得高速、高分辨率、低损伤和自由的大视野怎么办？21世纪初，选择/单平面照明显微镜（selective /single plane illumination microscopy，SPIM）应运而生，也就是我们前沿展望的主角之一：光片荧光显微镜（light sheet fluorescence microscopy）。不同于激发光的照明方式，光片显微镜的照明光是与成像面平行的一片薄 光，只有焦平面的样品被照亮，而其上下的样品不受影响。

光片荧光显微镜可提供相对较大物体（如发育中的胚胎）光学切片的快速成像，由于样本仅被薄薄的一片光照量，因此摄入的光剂量相对较低，允许长时间观测。

但在几何学上光片荧光显微镜存在一个挑战：大多数传统光片显微镜垂直排列两个物镜，一个用于照明样本，另一个用于接收射出的荧光，这种排列布局限制了能被安放和观察的样本类型，导致不同样本不得不采取创新策略进行安放和替代性的设备设计，包括采用一个物镜同时发光和观察，也就是单物镜光片显微镜（single-objective light sheet microscopy）。

单物镜SPIM显微镜利用微镜设备创造光片垂直到视觉轴，如此发散的荧光被提供照明的相同物镜收集起来，可用作细胞3D定位观察【1】。单物镜光片方法的应用还包括倾斜平面显微镜（oblique plane microscopy，OPM）【2】和扫描共聚焦同轴平面激发显微镜（swept confocally-aligned planar excitation microscopy）【3】。远距离调焦非常适合观察粘附在多孔板上的细胞以及自由移动的生命体。

最近，研究人员又利用OPM提升了单物镜光片显微镜的表现和适用性。这类产出包括单分子斜平面显微镜（single-molecule OPM，obSTORM），允许厚组织样本的超高分辨率观察【4】；而仰角光的单平面照明显微镜（epi-illumination SPIM）更能提供高分辨率和高通量的容积成像【5】；高数字光圈（high numerical aperture）OPM显微镜利用自定义物镜镜头能对标准摆放位置的具有挑战性的样本高质量的成像。

作者认为下一代单物镜光片显微镜将是生命科学发现的必要保障，反过来推进光片显微镜在未来成为主流。

参考文献

1. Nat. Methods 12, 641-644, 2015

2. Opt. Express 16, 20306-20316,2008

3. Nat. Photonics 9, 113-119, 2015; Nat. Methods 16, 1054-1062, 2019

4. Nat. Methods 16, 853-857, 2019

5. Nat. Methods 16, 501-504, 2019