单细胞测序分析不同大小的伤口揭示出具有再生能力的fibroblast

文章信息

文章题目：Single-cell transcriptomic analysis of small and large wounds reveals the distinct spatial organization of regenerative fibroblasts 
发表期刊：Experimental Dermatology
发表日期：2020年11月25日
DOI：https://doi.org/10.1111/exd.14244

摘要：

伤口诱导的毛囊新生（WIHN）已成为研究伤口修复过程中毛囊再生的重要模型。小伤口会形成疤痕，大伤口形成再生毛囊。本文结合分析了几个不同伤口大小的样本，意在找到毛囊再生过程中的关键真皮细胞群。

方法

比较了不同大小伤口的单细胞测序，以期阐明成纤维细胞谱系在WIHN中的作用。主要是三个单细胞测序的数据。

• GSE108677: 从他莫昔芬处理的P4-P5 Hic1- tdTomato小鼠的大伤口中取出细胞，并根据tdTomato的表达与否来分类。
• (1)D14的伤口中心，dTomato阳性，
• (2) D14的伤口中心，dTomato阴性，
• (3) D14的伤口周围，dTomato阳性，
• (4) D14的伤口周围，dTomato阴性。
• GSE112671: Tet-treated SM22-rtTA; tetO-Cre and R26-SmoM2/Tomato (SM22-SmoM2) and SM22-rtTA; tetO-Cre; R26-Tomato (control) mice at 12 days postwound
• GSE153596: Cells were isolated from small (2mm) wounds at 7 days postwound from wild-type P2 and P21 mice (n=3).

结果

1. 再生毛囊的伤口比成疤痕的伤口包含更多的upper wound fibroblast

upper wound fibroblast的 marker Crabp1；lower wound fibroblast的marker Mest 和Plac8 形成疤痕的小伤口中包含更多的lower fibroblast，而有毛囊再生能力的大伤口包含更多的upper fibroblast（fig I-L）

2. upper和lower fibroblast的RNA分化轨迹不同

RNA velocity通过计算未剪接和已剪接的mRNA的比例来预测scRNA-seq数据内的谱系轨迹，从而估计单个细胞的未来状态。本文中用SCANPY的scVelo。

在疤痕形成和再生伤口中，upper fibroblast轨迹远离lower fibroblast（图A-D）。upper fibro通常投射出不同于lower fibroblast轨迹。也就说明伤口愈合过程中成纤维细胞异质性的不同轨迹。

3. Hic1reticular lineage fibroblast对WIHN 可能没作用

scRNA-seq数据中的tdTomato表达，将所有库重新排列为包含tdTomato序列的参考基因组，用于再分析（图B）。新生成的 UMAP 包含 Crabp1、Mest、Plac8 和 Tgfbi 表达式确定的所有upper和lower fibroblas（图 3B 和未显示的数据）。接下来，我们将伤口位置和流排序 tdTomato 检测定义的四个条件叠加到新的 UMAP 上（图 3C）。如图3B、C、E、F所示，再生性DP主要由（85%）tdTomato 阴性的fibroblast 组成（图3C）。事实上，只有3%的新生DP来自LWC 14dpw Pos流式分选库。来源于 LWC 14dpw Neg 的再生DP的 tdTomato 转录本也是阴性 （图 3D） 。tdTomato转录本在再生性DP和cluster5中的upper fibro都没有检测到。（41.45%来自LWC和56.96%LWP）（图3D，E）。由此推断，大伤口毛囊新生成可能产生于upper fibroblast，可能不表达tdTomato，并且伤口外围和大伤口的中心再生能力是差不多的。

4. 伤口周围的upper fibroblast 也有再生能力的竞争性

主要看哪个细胞群具有转变为DP的可能性。数据中有三个主要的细胞群：

• ①lower fibroblast：Mest/Plac8
• ② upper fibroblast：Crabp1
• ③neogenic DP：Rspo3/Corin。

由图上看出，upper fibro与DP 更接近

总结

在再生伤口条件下，新发现的上伤口成纤维细胞过度表达，表达成维甲酸结合蛋白Crabp1。这种再生细胞类型与小鼠DP具有相似的基因标记，这对于支持毛囊形态发生和体内稳态是必需的。本文中scRNA-seq重新分析结合了多个样本，包括大伤口和小伤口的样本，表明upper fibroblast是毛囊再生所必需的，upper fibroblast在伤口皮肤上皮化过程中可能会从创面周围迁移到中心。

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