旷场实验在鼠行为学研究中的应用

董瑞 毕燕琳 王明山

青岛大学附属青岛市市立医院麻醉科 266071

国际麻醉学与复苏杂志,2020,41(05):535-540.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20190115‑00046

基金项目

贝朗麻醉科学研究基金（BBDF‑2019‑010）

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【综述】

Hall于1934年首先提出用旷场实验（又称敞箱实验）研究大鼠的情绪变化，经过不断的发展和完善，目前旷场实验主要用来观察实验动物的自主运动能力、对新异环境的探索行为、紧张度、躁狂、焦虑以及抑郁行为 ，由于其操作简单、可行性高、数据记录准确等特点，已成为研究动物精神领域较为流行的行为学测试方法。当实验动物罹患认知功能障碍时其探索行为将受到影响 ，因此，旷场实验还可对动物的认知功能进行评估 。在麻醉学基础研究领域中，旷场实验广泛应用于围手术期神经认知障碍模型小鼠或大鼠的行为学测试，大多数研究主要将其作为评判实验动物运动能力的一项检测指标。旷场实验干扰因素隐匿性强、实验参数多、分析组合相对复杂，不同研究中采取的旷场实验装置构成亦不相同，了解旷场实验流程、干扰因素、参数的选择和意义，对于实验动物的行为学判读具有重要意义。本文就旷场实验的装置构成、实验程序、观察指标、参数分析以及鼠的特性对旷场实验的影响进行综述。

1 旷场实验的装置构成

目前广泛应用的旷场实验装置主要由旷场反应箱和数据自动采集、处理系统两部分组成，数据自动采集、处理系统主要由录影机和跟踪系统软件构成，可监测实验动物运动轨迹等；基于不同实验设计，旷场反应箱装置有所不同，如在旷场形状、面积、材质、内壁颜色等方面不尽相同，见表1。旷场内可以不放置任何物体，也可放置不同颜色和形状的柱状物、平台、坑道等 ，以观察实验动物对外界新物体刺激之间的关系 ，目前大多数研究不再设置障碍或放置物体，但可利用旷场实验的装置，通过放置物体进行新物体识别和记忆实验 。因此，在进行旷场实验时应根据不同的实验设计选择不同的旷场类型和装置。

2 旷场实验的一般程序

旷场实验环境应隔音，光强度、温度和湿度适宜且保持一致。一般程序是在安静环境中，实验动物被放于旷场反应箱中，任其自由活动，指定时间内通过数据自动采集、处理系统记录以下指标：水平得分、垂直得分、中央格/周围格停留时间、修饰次数以及排便次数、中央格运动距离、周围格运动距离、运动速度和静止时间等。实验结束后，对旷场反应箱底部、放置物以及侧壁进行彻底清洁，以免本次动物余留的信息（如动物的大小便、气味）影响下次测试结果，大部分研究采用乙醇进行清洁，乙醇浓度亦各不相同，见表1。在测试下一只动物前须让乙醇完全挥发，如应用95%乙醇，挥发时间可能需要5~10 min 。实验前应使动物适应周围环境30~60 min，以消除新环境引起动物的好奇心和焦虑 。有研究指出，旷场实验开始前也应将动物放置于旷场中适应2 min，或适应10 min 。实验过程中严格控制时间及环境变量，避免暴力操作等造成动物应激的因素。实验过程中应保证受试动物不能看到研究人员，以免对动物的行为产生影响。

目前各项研究应用旷场实验探究鼠行为学的一般程序基本一致，但具体细节不尽相同，如最初将鼠放入旷场反应箱中，有的研究者是将鼠放在旷场反应箱的正中央 ，也有研究者将鼠面朝墙放入周围格中 ，或面朝墙放置于角落中 ，或面朝中央格放置于某一角落中 ，亦可放置于旷场反应箱的任何角落 ，但不管采取何种方式应当确保每只小鼠或大鼠放置位置一样，放在同一格、同一方向，同时要背向研究人员 。另外，对于动物在旷场实验箱中的观察时间亦不尽相同，见表1。

3 鼠的生理学特性对旷场实验的影响

鼠喜欢群居和穴居，开放的旷场实验使鼠从群体中分离，并且环境相对开放，以上两个因素可以引起鼠的焦虑 。研究显示啮齿类动物对旷场环境表现出明显的厌恶 。因此，对于鼠的旷场实验应当考虑到相关焦虑因素对观察结果的影响。

鼠具有趋触性，这使得比起旷场的中央部分，它们更喜欢在旷场的周边或角落活动 。鼠的趋触性主要取决于触觉，小鼠去掉触须后失去了与反应箱墙壁的触觉接触，也就不再有趋触性 ，这警示我们建立动物模型时应避免损害其感觉器官。有研究表明，当小鼠焦虑情绪增加时，这种趋触性更为明显 。

光照条件对鼠的生物节律和活动度有影响 。鼠在暗环境中的活动度较强，因此，在不研究光照对鼠活动性的前提下，旷场实验应在避光环境中进行。亦有研究在明亮环境下进行旷场实验 。目前部分研究直接指出的实验光照强度有100、150 lux和165 lux ，当然，这也应结合所采用视频分析系统的色彩区别阈值进行设定。整个旷场区域亮度应保持一致，除特殊实验目的外不应出现明暗不一致的区域 。鼠的活动度呈现昼夜节律变化，上午（9：00~11:00）和傍晚（18：00~20:00）活动度高 。

不同性别的啮齿类动物行为学表现不同。目前用于实验研究的啮齿类动物均为模式动物，其与自然繁殖的动物不同，过早的处于母幼分离环境中，研究发现对于早期处于母幼分离的雌性小鼠，其成年后社交行为和焦虑情绪增加，雄性小鼠在社交行为和焦虑情绪上没有变化，但其运动和探索能力受到显著影响 。

不同品系的动物在旷场实验中表现出不同的焦虑和自主运动能力 。这可能与遗传因素有关，如C57BL/6小鼠相比BALB/c小鼠在旷场实验中具有较强的探索行为能力，而BALB/c小鼠却更多地表现出焦虑行为 ；C57BL/6小鼠相比于DBA/2J小鼠，其中央格的运动距离升高 。因此，利用旷场实验对特定行为参数和特定物种进行研究时，应该基于研究对象实验基线进行比较。

此外，大鼠的抑郁情绪可以像人类一样影响同类，将正常大鼠和抑郁模型大鼠共同饲养5周后，正常大鼠表现出明显的抑郁，而抑郁模型大鼠抑郁症状减轻，说明抑郁情绪可以在大鼠中相互影响 。因此，在进行旷场实验时应该重视上述特性对实验结果的影响，最大程度上将影响旷场实验结果的干扰因素降到最小。

4 旷场实验结果参数的意义

不同的实验设计可采用不同的旷场实验结果参数进行统计分析，目前比较常用的结果参数主要有以下几种。

总路程：可进一步划分为中央格路程和周围格路程，反映鼠的活动能力 。鼠在新环境中是由紧张、兴奋、探索再到适应的一系列过程，处于兴奋状态的小鼠表现为行动活跃，四处走动，总路程增加。当小鼠处于抑郁状态时，其运动路程明显缩短，但总路程过长反映鼠对新环境的恐惧 。值得注意的是，学习和记忆能力受损不会引起与小鼠运动能力相关的参数变化 ，亦不会导致旷场实验中焦虑行为的产生 。

运动时间：指鼠在旷场实验中运动的总时间，分为中央格运动时间和周围格运动时间。

静止时间：指视频分析系统根据人为设定的不动阈值所计算出的动物完全静止的时间。静止时间反映动物的焦虑水平和运动能力，静止时间越长说明动物焦虑程度越高，抑郁程度越高，运动能力越差 。小鼠较差的运动能力和较长的静止时间是抑郁的表现 ；另有研究指出静止时间反映小鼠对周围环境的好奇心，静止时间越短，小鼠好奇心越强 。

平均速度：鼠在旷场实验中运动总路程和时间的比值，可表示鼠的自主运动能力 。

跨格次数：又称水平得分，跨格一次是指鼠四足均进入相邻方格范围内 ，分为中央格跨格次数和周围格跨格次数。有研究单纯应用跨格次数这一指标来反映大鼠的活动能力 。跨格次数的多少反映鼠的自发活动程度及兴奋程度，大鼠出现抑郁时跨格次数减少 。

中央格跨格次数：单纯指动物进出中央格的次数。对于中央格的界定目前主要有两种方法，一种将与旷场反应箱壁相连的方格或者区域称为周围格，不与反应箱壁连接的区域称为中央格 ；另一种将中央格定义为与反应箱壁有一段距离的区域 ，至于这段距离的长度可根据试验设计具体设定 。以上两种方法中，第1种方法较为常用。中央格跨格次数减少与小鼠焦虑状态相关 。

直立次数：又称垂直得分、站立次数，指鼠一对前足均腾空或攀附箱壁，站立后双爪放下为直立一次。直立次数反映鼠的探索行为及对新环境的好奇程度 ，然而在直立次数与焦虑情绪的关系上，目前没有定论，有研究认为直立次数越多，说明动物越焦虑 ，而另有研究认为直立次数越少，动物越焦虑 。大鼠出现抑郁行为时，直立次数减少 。

排便次数：又称粪便粒数，反映动物对陌生环境的紧张和恐惧程度，自1934年Hall等首次将啮齿类动物的排便次数与情绪建立联系之后，人们普遍认为排便次数反映啮齿类动物的焦虑程度 。最近有研究指出，在较短的实验时间内，排便次数确实可以作为反映动物焦虑情绪的有效指标，但如果实验时间超过30 min，其与焦虑情绪的相关性还有待深入研究 。

修饰次数：又称理毛次数，指鼠对面部、四肢、躯干和生殖器的清洗行为。鼠的修饰次数是对新异环境产生的应激行为，说明此时鼠兴奋度较高，也有研究认为修饰次数反映动物身处新异环境时的警觉强度 。

中央格停留时间和中央格停留时间百分比：鼠被放于中央格后至其四足均离开中央格时的这一时间段和这一时间段占旷场实验时间的比值即为中央格停留时间和中央格停留时间百分比。啮齿类动物在空间活动时会本能避开中央区域，沿着边缘区域活动，理论上当鼠的认知能力受到影响时会导致其中央区域停留时间延长。Yadav等 指出，如果动物对新环境的认知能力差，则中央格停留时间延长。然而,有研究认为中央格停留时间的减少说明动物具有焦虑行为 。中央格停留时间与鼠对周围环境的好奇度呈反比。

中央格运动时间和中央格运动时间百分比：指整个旷场实验中鼠在中央格运动的总时间以及其所占旷场实验时间的百分比。中央格运动时间增加与鼠的探索行为密切相关 ，中央格运动时间/中央格运动时间百分比降低是鼠焦虑的表现 。

周围格运动时间和周围格运动时间百分比：整个旷场实验中鼠在周围格运动的总时间以及其所占旷场实验时间的百分比。研究发现鼠在旷场中央运动的时间增加，以及从周边到中央潜伏期（将动物放入周围格，动物从周围格进入到中央格的时间）的缩短是焦虑的表现 。

值得注意的是，对于上述诸如修饰次数、站立次数、排便次数等指标，是无法采用视频分析设备自动计算出来的，而对于可用视频分析设备计算出的指标也涉及到相关阈值的设定，因此这使得不同研究者采用不同设定阈值可出现不同的研究结果。另外，在旷场实验中，啮齿类动物不同的行为之间可相互影响，如小鼠跨格次数和直立次数的增多可引起其修饰次数的减少 。

5 旷场实验参数分析新思路

在行为学测试中并不单单进行旷场实验，而是包括其他诸多测试（如条件恐惧实验、新物体识别/记忆实验、明/暗箱实验、水迷宫实验、巴恩斯迷宫实验、高架十字迷宫实验等），将不同测试的参数综合分析更能客观描述啮齿类动物的行为学变化。Bello‑Arroyo等 开发了一种包括旷场实验、高架十字迷宫实验、Y迷宫和水迷宫的MouBeAT系统，能较为精确地进行啮齿类动物行为学测试分析。但是动物在序贯接受不同行为学实验的过程中，要注意旷场实验与其他实验之间的相互影响，Moon等 发现，小鼠在接受强迫游泳实验2周之后，其残余应力效应依然会影响旷场实验的结果，同样先进行旷场实验亦会影响强迫游泳实验的结果。

旷场实验的单一参数不能充分反映动物的认知、情绪及探索能力方面的变化，在具体研究实践中，将不同参数进行组合分析能更全面地反映实验动物的行为特征变化。如在针对小鼠抑郁行为评定时，Wu等 使用小鼠运动静止时间、修饰次数、跨格次数、直立次数等进行综合分析；Abdulmajeed等 使用静止时间、垂直次数和跨格次数3个参数来分析大鼠的焦虑水平和自主运动能力，其认为在旷场实验中大鼠垂直次数和跨格次数愈高、静止时间愈短说明其自主运动能力和探索能力愈强，焦虑水平愈低；苏云祥等 通过将水平得分和垂直得分作为旷场实验总得分，并通过研究证实多次测量旷场指标后，发现适当的数据聚合可显著提高大鼠旷场实验指标的可信度和稳定性，但数据聚合的方式是否适用于小鼠还有待研究。

目前对于围手术期神经认知障碍的研究领域，模型动物术后需采用条件恐惧实验和迷宫实验等行为学测试来评估模型动物的认知能力，如不同组间的动物运动能力不一致会对上述行为学结果造成影响，为了衡量这一干扰因素，研究者经常采用旷场实验对动物的运动能力进行评估。旷场实验不仅能反映动物的运动能力，我们还可以对它的参数进行综合分析，以评估实验动物在整个测试流程中情绪、兴奋度、认知能力等指标的变化。Peng等 设计的由埋藏食物实验、旷场实验和Y迷宫组成的复合Z评分系统来测试小鼠术后谵妄的发生也为不同行为学实验之间的数据聚合方式提供了新思路。另外，还应注意水迷宫实验对旷场实验的影响，在水迷宫实验中对于找不到平台的动物，在一定程度上等于对其进行了一次强迫游泳实验，而强迫游泳实验是构建啮齿类动物抑郁模型的方法，会造成实验动物的抑郁，并且这种损害是永久的、不可逆的 ，从而对后续的行为学检测产生干扰，影响实验动物认知能力的判定。尽管水迷宫实验和强迫游泳实验在诸多环节上不同，但旷场实验与水迷宫实验之间的相互影响还是值得进一步探究。

6 小 结

旷场实验作为啮齿类动物重要的行为学研究方法，对评判啮齿类动物的运动能力、情绪改变认知能力等具有重要作用，但在实际应用中要根据具体实验目的合理调节实验装置构成，严格控制实验干扰因素，科学选择实验研究参数，综合分析并判读实验结果。同时，在对实验动物序贯进行不同行为学测试时，不同行为学测试之间的相互影响还需进一步研究，以规范行为学测试流程。

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