有没有 简单好用又便宜的miRNA qPCR检测方法？

没有？

这个可以有！

不顾正业的老司机hzangs又出现了!

外泌体中miRNA的研究近期十分火热，但是miRNA的qPCR检测却不是那么方便，好的方法贵，自己的方法又未必work！！！为了解决这个问题，老司机今天出马了！！！（ 此处应该有掌声！）

Hzangs今天给大家介绍一个简单好用又便宜的miRNA qPCR检测方法。当然，它不可能比taqman的检测方法更好，只是在经费有限又需要尝试做几个miRNA qPCR的情况下可以使用这个方法，毕竟taqman检测虽好，但一个miRNA的检测费用就上千块，有点肉疼。好了现在开始安利hzangs学到的这个方法，这个方法包括miRNA逆转录和miRNA SYBR-qPCR检测方法两部分。

重要提示！读完整个推文再去做这个实验！！！

Part1：

左半部分！ 哦，错了。第一部分：miRNA逆转录。miRNA属于小RNA大类，成熟的miRNA很小，只有20nt左右，这使得miRNA利用SYBR检测相对比较困难，为了解决这个问题，本次安利给大家的方法使用了加尾法来加长miRNA cDNA的长度。起始RNA可以是抽提的总RNA或者是抽提的miRNA。

（PS 关于使用总RNA还是纯miRNA的讨论：根据hzangs的个人经验，如果你检测的是高丰度miRNA，qPCR Ct值在10-15左右，总RNA没什么问题。如果是低丰度的miRNA，可以考虑用纯的miRNA作为模板。如果你是提取血浆miRNA，那还是考虑用纯的miRNA吧。）

一般使用的加尾都是利用polyA加尾酶实现的。这个酶不是很贵，而且用量也比较小，大家根据自己的需求可以在NEB、takara等公司买到。按照相应产品的protocol完成加尾步骤即可。

加个尾巴变化还是蛮大的嘛

之后进行逆转录，逆转录也是根据同学们实验室的试剂盒自行安排，但是逆转录用的引物（即逆转录试剂盒中 oligodT 和 random 6 等组分，也有试剂盒直接标名称为 RT primers）更换一下，你需要自行合成一条逆转录引物，引物序列我安利给你们。

RT-primer：CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN

稀释成100uM的浓度，20uL逆转录体系加1uL即可。

逆转录结束，你拿到可以用于SYBR-qPCR的模板。你已经完成了工作的一小半。

Part2：

后半部分，哦！错了。第二部分：既然是qPCR，那就离不开引物，现在我们设计引物吧。安利大家对应的miRNA qPCR引物设计软件，完全不需要你动脑，只要将你需要检测miRNA贴进文件里，双击一下软件，你的引物就出来了！！！

打开这个文件

将你待检测的miRNA按照下里面的格式贴进去。一次可以贴N条！

保存文件并关闭。然后双击下面这个图标

出现下面界面 运行完毕后点 回车

你需要的引物都在这个文件里！

把引物序列送到引物公司合成，合成完了之后按照常规的SYBR-qPCR方法进行试验即可！全部的东西都在这里了！是不是很简单！

用了这个方法做实验，发了paper记得要引用技术发明者的paper哦，title放在这里给大家看看~

结束了！

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怎么感觉少了点什么？

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哦！ 对了好像引物设计软件没有给大家！

论坛对应的同名贴下 大家自己下载吧。哈哈哈哈哈

请准许我在说一次！

完美！