【文献解读】CRISPR
原标题：【文献解读】CRISPR-Cas9技术研究C/EBPβ增强子在肝细胞癌作用机制
文章导读
肝细胞癌（HCC）表现出不同启动子发生超甲基化模式，但是转录增强子的表观遗传调控和功能在肝癌进展中的作用机制目前仍不清楚。我国的研究员基于WGBS分析揭示了人HCC的增强子低甲基化情况。其中C/EBPβ增强子在肝癌细胞中低甲基化比较显著。经验证C/EBPβ增强子与C/EBPβ的过表达和患者预后相关。研究人员通过去除C/EBPβ增强子甲基化，结果发现C/EBPβ恢复了自我强化增强子靶向环。通过CRISPR/Cas9技术（捷易可提供此项服务）敲除增强子后，C/EBPβ表达下调，导致驱动癌基因和肝癌致瘤性的急剧下降。这些结果表明C/EBPβ增强子低甲基化及C/EBPβ增强子本身与C/EBPβ高表达之间的存在因果关系，从而促进肝癌的发生。
期刊：NATURE COMMUNICATIONS IF：11.9
文献链接：https://doi.org/10.1038/s41467-018-08245-z
捷易提供CRISPR-Cas9基因编辑服务服务。基因编辑技术在研究基因下游机制，基因型与表型关系上，是不可缺少的工具。而CRISPR-Cas9技术是新兴的基因组编辑工具，可对任意位置DNA序列进行编辑且操作简便，使用该技术能够进行细胞水平和动物水平的单基因或多基因的组成型/条件性/组织特异性敲除，敲入或定点突变。这一技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。
研究框架
注：红色框内的CRISPR-Cas9，捷易提供此项实验服务
研究亮点
1.首次研究人肝癌细胞增强子低甲基化模式；
2.通过CRISPR/Cas9介导增强子C/EBPβ缺失，消除了肝癌细胞致瘤性。
研究结论
本研究对HCC肿瘤组织的DNA甲基化的图谱进行研究，发现C/EBPβ增强子的低甲基化与预后及癌细胞增殖能力侵袭能力有关，为DNA低甲基化剂作为癌症治疗提供依据。另外，也有可能通过CRISPR/Cas9介导增强子重新编程提供更具体的治疗策略。
研究结果
1、HCC的综合表观基因组分析
对33对HCC癌组织和癌旁组织进行DNA甲基化的测序（MBDCap-seq），数据展示，与癌旁组织相比，癌组织中DNA更倾向发生低甲基化。另，通过对三个肝癌肿瘤组织进行全基因组甲基化测序（WGBS)，以确定在其核心区域具有显著差异甲基化的增强子。其中854个增强子是发生低甲基化的，只有40个是发生高甲基化。C/EBPβ是关键肝细胞转录因子，发现HCC中C/EBPβ为靶基因的增强子（C/EBPβ enhancer）显著低甲基化。
图1 HCC细胞的发生低甲基化
2、C/EBPβ增强子低甲基化与HCC患者预后差相关
WGBS数据表明肿瘤组织中C/EBPβ增强子的13个CpG位点展现了低甲基化。通过RT-PCR技术检测了C/EBPβ增强子低甲基化与C/EBPβmRNA表达呈显著的负相关。而C/EBPβ启动子的甲基化水平在癌组织和癌旁中并无显著差异，且位点突变也较少。这些数据表明，C/EBPβ增强子低甲基化是C/EBPβ高mRNA表达主要机制。
基于多数肿瘤组织中C/EBPβ增强子发生甲基化，研究人员进一步研究了该增强子甲基化是否与肝癌患者的生存有关。发现，C/EBPβ增强子低甲基化与HCC患者的低生存率相关。
图2 C/EBPβ增强子低甲基化与HCC患者预后差相关
3. C/EBPβ增强子低甲基化激活C/EBPβ表达
研究人员推测C/EBPβ增强子低甲基化影响eRNA的表达，从而影响C/EBPβmRNA的表达。焦磷酸测序及RT-PCR实验结果表明，肝癌细胞中C/EBPβ增强子低甲基化与eRNA的表达呈显著的负相关。为了确认这个因果关系，用5-aza-dC处理肝癌细胞去除增强子的甲基化，结果导致C/EBPβeRNA和mRNA表达量增加。为了进一步确认上述因果关系，研究人员通过RNAi技术敲低了HepG2和LO2细胞中C/EBPβeRNA，结果显示在两个敲除的C/EBPβ eRNA的细胞系中C/EBPβ的mRNA水平是降低的。这些结果表明，C/EBPβ增强子低甲基化诱导eRNA产生，从而激活C/EBPβ表达。
图3 C/EBPβ增强子低甲基化激活C/EBPβ表达
4. C/EBPβ反馈调控C/EBβ增强子的活性
研究人员推测低甲基化的C/EBPβ增强子是与一些转录复合物一起作用来促进eRNA表达。
研究表明C/EBPβ增强子低甲基化确实增加了C/EBPβmRNA、BRD4、H3K27ac和RNA聚合酶II（RNPII）的表达。接着，使用BRD4抑制因子JQ1来处理HepG2和LO2细胞，或敲低C/EBPβ基因，结果与C/EBPβ增强子低甲基化调控效果一致，即减少了C/EBPβeRNA的水平。结果表明，C/EBPβ反馈调控C/EBβ增强子的活性。
图4 C/EBPβ反馈调控C/EBβ增强子的活性
5、C/EBPβ增强子的缺失消除了肝细胞癌致瘤性
为了阐明C/EBPβ 增强子在肿瘤发展中生物学和功能意义。研究人员通过CRISPR/Cas9技术在HepG2和LO2细胞模型中敲除了单等位（C/EBPβenh /-）和双等位的C/EBPβ增强子（C/EBPβ enh-/-）。转录组分析发现与野生型细胞（C/EBPβ enh / ）相比，实验组细胞显示出显著降低的C/EBPβ eRNA和mRNA表达。在功能功方面发现，C /EBPβ增强子的单等位和双等位基因缺失癌细胞的生长能力以及降低其侵袭性能力是降低的。以上结果表明，C/EBPβ增强子的缺失消除了HCC致瘤性。
图5 C/EBPβ增强子的缺失消除了肝细胞癌致瘤性
捷易生物CRISPR-Cas9服务:
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稿件来源：营销中心 Tina
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