Dkk3基因敲除小鼠模型构建技术原理

有研究通过同源重组的方式构建了Dkk3基因缺陷小鼠模型。等位基因缺陷纯合子的小鼠可正常生存、可育的、甲状腺正常，但表现出亢奋的精神状态，自然杀伤细胞比例显著下降，IgM、血红蛋白和红细胞压积水平显著升高^[4]。

在小鼠中，Dkk3缺陷会促进动脉粥样硬化的发生。研究人员将Dkk3缺陷小鼠和ApoE缺陷型小鼠杂交，用以产生Dkk3和ApoE双基因缺陷型小鼠。接着，主动脉的油红染色切片的分析显示（图2C），DKK3^+/+/ApoE^‒/‒小鼠的病变程度比DKK3^‒/‒/ApoE^‒/‒小鼠要小（图2A和2B）。免疫荧光分析显示，与DKK3^‒/‒/ApoE^‒/‒小鼠相比，DKK3^+/+/ApoE^‒/‒小鼠（图2A和2D）病灶中的αSMA染色显著增加。此外，对CD68标记物的染色显示DKK3^+/+/ApoE^‒/‒小鼠中损伤的巨噬细胞的数量减少（图2A和2D）。这些数据共同表明，DKK3可能对ApoE^‒/‒小鼠的动脉粥样硬化具有保护作用^[5]。

图. 在20周龄时对接受正常饲料喂养的小鼠进行安乐死，并采集其心脏和主动脉。切开主动脉根部，固定主动脉用油红染料进行染色并测量和量化主动脉窦及表面的病变区域。切片分别用抗α平滑肌动蛋白（SM α-actin）和CD68抗体进行免疫染色，之后在显微镜下对阳性细胞进行计数。

A、使用油红染色主动脉窦具有代表性的切片图片，α-平滑肌肌动蛋白抗体标识出平滑肌细胞，CD68抗体标识出巨噬细胞；B、在表面着色病变区域中量化αSMA和CD68阳性细胞数量。

C、病变区占总表面积的百分比。

D、总细胞中αSMA和CD68阳性细胞所占百分比。

研究人员发现，Dkk3缺陷型小鼠在缺血时梗死面积增大。在大脑中动脉闭塞手术处理之后，Dkk3^−/−组小鼠脑部梗死体积都明显增大（图3A，B），这表明内源性DKK3对大脑缺血的损伤具有一定的抵抗作用。还能观察到，在缺血病灶周围的大脑皮质内侧和下部检测到Dkk3免疫反应性增加，说明该区域可能包含缺血半暗带。从图3c可以发现，在大脑中动脉比赛手术之后12h，Dkk3的含量在病灶周围有显著增加。不仅如此，GFAP和Dkk3的双重荧光染色表明星形胶质细胞在很大程度上促进了缺血病灶边缘Dkk3表达量的增加（图3D），但是我们也能观察到其他类型的细胞也表达Dkk3（见图3D中的箭头），但总的来说，Dkk3对缺血后的脑区梗死具有一定的抵抗作用^[6]。

图. （A）大脑中动脉闭塞（MCAO）后1天，在野生型和Dkk3基因敲除小鼠中，沿缺血损伤的区域每隔320µm收集10µm冠状小鼠脑切片并做Nissl染色。（B）MCAO后1天、3天和7天，在野生型和Dkk3基因敲除小鼠中计算梗死面积。（C）MCAO后6小时和12小时收集野生型小鼠大脑皮质并做Dkk3的免疫组织化学进行分析。结果为病灶区低倍和高倍成像。（D）MCAO后12h野生型小鼠缺血皮质中Dkk3和GFAP的双重免疫荧光染色。三角标显示星形胶质细胞中Dkk3的表达。箭头显示在GFAP阴性细胞中Dkk3的表达。