引物设计原则是什么？

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；

2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之间。

4、引物3’端的碱基一般不用A。A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

6、 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增。

7、 使用BLAST检索，确认引物特异性