【文字版】林瑞庆：产气荚膜梭菌及其检测技术
在正典生物特约蓄牧思维云课堂“家禽替抗药物筛选技术与替抗方案”系列讲座上，华南农业大学兽医学院兽医寄生虫教研室主任林瑞庆老师带来《产气荚膜梭菌及其检测技术》，以下是文字内容：
鸡坏死性肠炎——饲料禁抗后养禽业最大的挑战
产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎（NE）是养鸡业危害最大的疾病之一，造成巨大损失；常发于2~6周肉鸡，11周龄前肉鸡以及3-6月蛋鸡也多有报道。
急性型突然大量死亡，空肠、回肠粘膜大量弥漫性坏死灶，蔓延至十二指肠、盲肠，死亡率常在2%~10%之间；亚临床型不表现明显临床症，但肠粘膜损伤，采食量降低、生长受阻，有时还伴有肝炎和胆管肝类。
据美国家禽病理学会（USAHA）的年度报告，球虫病是近30年来发生率和经济损失位居前五的主要疾病，2017-2019年均位列第一。坏死性肠炎则紧随其后位居第二。作为一种“复燃的疾病”，鸡NE被视为饲料禁抗后养禽业最大的挑战。
产气荚膜梭菌的特点与流行病学
1、病原形态
产气荚膜梭菌是一类革兰氏染色阳性、可形成荚膜、产芽孢的艳阳性人兽共患致病杆菌。
2、病原特点
（1）在自然环境中分布极广，是人畜肠道的一种常在菌。
（2）机会致病病原，在一定条件下，可引鸡急性或亚临床型NE。
（3）厌氧菌，但对厌氧程度要求不严格，对营养要求不苛刻。
（4）形成芽孢，能抵抗不良环境，在传播中起重要作用。
（5）肠道细胞、胆酸类以及各种营养成分有助于芽孢萌发。
（6）快速增殖，约8~12min—代。
（7）产生致病因子已鉴定有二十多种外毒素和水解酶，根据6种主要毒素目前可分为7种型（A-G），鸡主要为A、C、F和G。
3、流行病学
（1）各品种禽类均可感染，一年四季均可发生，尤以潮湿温暖的季节发病较多。
（2）多发于2~6W：母源抗体 内外环境因素。
（3）芽孢在恶劣环境条件的影响下具有很强的存活力，可存活数年。
（4）健康家禽分离到的产气荚膜梭菌通常不致病。
（5）临床分离株的耐药性问题突出：氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、林可胺类等耐药性广泛存在。
（6）各种诱因（球虫病等）引起肠道内环境变化，产气荚膜梭菌增殖引致NE。
国外关于商品鸡NE大规模流行病学调查报告显示发率5.3%-12.3%，高峰期至35%，由于缺乏方便、可靠的调查方法，大规模调查数据有限。国内鸡NE没有系统的调查，但近年有大量的病例报道，表明该病流行极广，危害较大，日益引起关注。
4、症状及病变
急性型病鸡表现精神萎顿、嗜睡、羽毛蓬乱、食欲减退，有的严重腹泻，有些排带血粪便。病程持续时间短，通常经过1~2天死亡，病死率每天为0.3%~0.5%。
亚临床型鸡肠道黏膜发生慢性损伤，鸡群采食量降低、体重下降、料重比升高，种鸡的整齐度较差，有时还伴有肝炎和胆管肝炎。
病变情况
亚临床型NE常出现非出血性溃疡，多点深层溃疡，形成假膜还有胆管肝炎。急性型NE的表现就更严重一些：内容物水分多，炎性渗出；粘膜充血、出血、溃疡；弥漫性出血斑；肠腔内多量气泡；比肠道充胀气体，肠壁薄脆；上肠腔充血等。
鸡肠道病原的鉴别诊断
从粪便鉴别来看，球虫病粪便为拉稀或带血；而坏死性肠炎的粪便有比较多的颜料色，还带有粘液、肠粘膜脱离物和未消化的饲料等混杂成分。
临床上如果只是对粪便鉴别还是比较难区分的，为此，需要进行解剖，进行肠道病变鉴别诊断。主要鉴别小肠中后段的病变，球虫病变可能会出现出血点（巨型艾美耳球虫）或黑白斑点（毒害艾美耳球虫）；而产气荚膜梭菌病变会导致肠道弹性变差、肠壁变薄、出血斑点，肠腔胀气、充满液体，肠黏膜充血、坏死，附着纤维素和细胞碎片等。
最终需要通过肠道刮片等进行病原学诊断来进行确诊。
产气荚膜梭菌检测技术
1、样品采集
采集坏死性肠炎病鸡或疑似病鸡的肠道或粪便，优先选择肠道，粪便放置时间长就不容易分离。需要注意不要采集已经病死的鸡的样品，因为病死后容易被外界产气荚膜梭菌污染，并且常在菌可能增殖，失去了检测的意义；还需避免采样时的交叉污染。
2、检测方法
方法一：染色镜检
刮取肠道病变部位粘膜，革兰氏染色后镜检，。但最好先进行细菌分离后镜检鉴定。需要注意掌握脱色程度，如脱色过度，阳性菌可被误染为阴性菌；菌龄影响染色结果，培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解,常呈阴性反应。以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈现假阳性。
方法二：细菌分离
肠道内容物、粪便或内脏组织先经液体培养基（如液体硫乙醇酸盐培养基等）增菌。
增菌后再分离，可用多种鉴别固体培养基培养分离鉴定。
TSC卵黄平板的选择性抗生素（多粘菌素或环丝氨酸）可对某些厌氧菌或兼性厌氧菌有抑制作用而具有一定的选择性；培养基含铁和亚硫酸盐，形成一种黑色的硫化铁沉淀即黑色菌落；TSC平板还含卵黄，产气荚膜梭菌产生的卵磷脂酶水解卵黄卵磷脂，使黑色菌落的周围形成一个不透明的晕（Nagler反应）。
除了注意操作上的规范，在TSC卵黄平板的基础上，覆盖一层无卵黄TSC，将显著提高分离率。
纯化和保菌：取单菌落接种FT液体培养基，将管内的培养物混匀用接种环蛇形划线于TSC的平板上，40℃厌氧培养16-24h。黑色单菌培养后进一步鉴定，后加20%的甘油，标记信息，用封口膜封好，放入-20℃或-80℃冰箱保存。
方法三：生化鉴定
根据产气荚膜梭菌的生化特性进行分析，对牛乳培养基的'暴烈发酵“是最突出的生化特性，发酵乳糖使其酸凝，产生的大量气体又使其破裂成多孔海绵状。
方法四：分子鉴定
通过PCR扩增16S rDNA测序分析。
技术路线图
可通过多重PCR扩增产气荚膜梭菌的主要毒素基因进行鉴定和分型。
在林瑞庆老师的分享结束后，有许多网友提出了自己关于产气荚膜梭菌这方面的疑惑，林老师在蓄牧思维云学院线上回复了网友的问题，下面是互动问答汇集：
网友
林老师，怎样降低有机肉鸡坏死性肠炎发生率？
林瑞庆
有机鸡因为不能使用化学药物、抗生素等方法控制传染性疾病，所以需从生物防控和管理环节等减少疫病的发生。
先从坏死性肠炎发生的原因来去考虑，坏死性肠炎由产气荚膜梭菌引起，而该菌是一种机会性致病菌，所以它的发生有一定的诱因。从产气荚膜梭菌引起坏死性肠炎的因素来看，维持肠道稳态是关键。需要有清洁的水源和优质饲料；此外，高饲养密度还有应激等问题都会导致鸡的生理状况变化，引起肠道紊乱；还有如球虫等肠道疾病和病毒病等破坏肠道粘膜完整性，诱发坏死性肠炎，需要进行相应的预防和控制。总之，需要从各个方面维护好鸡的肠道，减少坏死性肠炎的发生，降低环境中的产气荚膜梭菌数量。还可进行定期或不定期监测，及时处理感染的病鸡，减少环境中产气荚膜梭菌的存在。
网友
林老师，我用球虫疫苗结合产气荚膜杆菌攻毒，只有肠壁变薄的现象，是严重还是不严重？
林瑞庆
可能这位网友想做动物模型，一般国内的疫苗基本是弱毒苗，致病性比较弱，对肠道的损伤比较少，不易诱发动物模型。
我们做动物模型一般使用球虫强毒攻毒作为坏死性肠炎的诱发因素，这样对肠道损伤会比较严重，细胞破裂、肠道出血、蛋白质泄漏在肠腔中，这些就很容易触发产气荚膜梭菌的增殖。产气荚膜梭菌增殖速度很快，同时产生大量的毒素，对肠道的破坏非常严重。球虫强毒感染作为诱因，加上产气荚膜强毒株攻菌比较容易制备动物模型，有时还可以加入高蛋白的影响因素。
如用球虫疫苗的话，需要大量攻虫。
网友
林老师，有没有针对鸡坏死性肠炎的替抗防治方案？
林瑞庆
这个问题提的非常好，大家都知道要禁抗，很多人也都在尝试一些替代方案，但有好有坏，很难一一评估。
坏死性肠炎的最大诱因是球虫病，所以要防控好坏死性肠炎，就需要防控好球虫病。球虫防控方法有药物和疫苗，因为药物的耐药性严重，加上药物残留等公共卫生问题，球虫药防控有明显局限性。而目前我国球虫疫苗的应用非常广泛，取得的效果也非常好，完全可以替代抗球虫药，所以长远来看球虫可以考虑疫苗防控。
坏死性肠炎常继发于球虫病，因为原来抗生素促生长剂的应用抑制了坏死性肠炎的发生，所以基本上很少见，现在禁抗之后作为一种“复燃的疾病”变成很常见了。这样在疫苗控制球虫病的前提下，用什么来控制产气荚膜梭菌呢？考虑到我国禁抗后还允许使用球虫药，而球虫药里有几种离子载体类抗生素，这类抗球虫药实际上对梭菌是一种非常好的防治药物，在国外已经普遍用来防控鸡坏死性肠炎。所以我们就提出一个策略，小鸡阶段用疫苗免疫控制球虫，消除或减轻坏死性肠炎诱发因素，然后因为产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎一般发病会较迟，所以在中、大鸡阶段用离子载体类抗生素控制梭菌。坏死性肠炎的防控关键是维护肠道健康，如能精细化管理，保证优质的饲料和水源等，减少环境病原，不用药一样也可以，另外蛋鸡等不能用抗生素的，可考虑对梭菌有效的替抗产品与球虫疫苗组合。我国因为饲养环境复杂，有很多地方区域产气荚膜梭菌病原还是广泛存在的，球虫疫苗 离子载体类药物联防球虫病和坏死性肠炎我认为也是比较好的防控方案，供大家参考使用。
网友
林老师，怎么能有效预防？万一感染后怎么有效治疗？
林瑞庆
有效的预防就是不让产气荚膜梭菌有萌发增殖的机会，维护肠道健康，消除诱因。有效治疗先要正确诊断，然后是要用对药物。最近有一个场发生了坏死性肠炎，但是误判为球虫病，使用球虫药没效，后正确诊断后用地美硝唑和阿莫西林这些抗梭菌药后才控制了病情，所以辩证很重要。因为产气荚膜梭菌的耐药性非常严重，一旦发生，用对药才能控制住，在不了解该区域菌株耐药性的情况下用药往往难以取得好的效果。
网友
林老师，防控方案是要周期性的做吗？还是根据季节不同，采取不同方案呢？
林瑞庆
我建议长期做。因为梭菌广泛存在，之前是抗生素促生长剂的使用得到良好的控制。而从去年国家执行饲料端禁抗后鸡产气荚膜梭菌分离率开始升高，很多临床发病场的阳性也比较高。加上这个病也受季节影响，跟球虫病相似高温高湿的天气要格外关注，根据可能的诱因采取相应防控措施。
网友
林老师，微生物制剂，对这种肠道疾病有效果吗？哪种效果更好呢？
林瑞庆
益生菌在预防坏死性肠炎尤其是亚临床型坏死性肠炎方面有一定效果，对肠道黏膜有修复作用及对肠道微生物平衡有积极作用。有些益生菌对产气荚膜梭菌增殖确实有抑制作用，比如丁酸梭菌等产品，会对产气荚膜梭菌有比较好的防控作用，益生菌的作用不在于治疗，而是在预防或者药物治疗之后用以恢复肠道菌群稳态效果比较好。
网友
林老师，在分离培养的时候，怎样才能避免被杂菌污染呢？
林瑞庆
首先采样步骤非常重要，采样时一定要注意避免交叉污染和环境污染。单独换手套，重复使用的器械要消毒等。另外，对于产气荚膜梭菌的样品要新鲜，鸡死亡后会有其他梭菌大量增殖，分离出来的就不单是致病病原，会干扰检测。
第二是具体操作要规范。
第三是分离方法。不同方法的分离率和抗杂菌干扰能力是不一样的。之后希望大家掌握分离技术加入抗梭菌的行动中。
网友
林老师，分离出来细菌，后续如何进行药敏试验？选取药敏药物？
林瑞庆
我们一般会先了解养殖户常用药物及考虑使用什么药物，然后进行评估。一般使用牛津杯法，药物有些可溶，有些需使用超声波处理，但基本上可以找到溶剂处理，形成液态药物使用牛津杯法。对临床分离的菌株，这算是一个比较好的评估方法。实验室分离的细菌都会做MIC实验，更偏向于大量菌株耐药性分析这样的情况。通常对于分离的某一个菌株用牛津杯法可以比较简单地判断出对某些药物的耐药性。
网友
林老师，药敏LB琼脂菌株厌氧培养生长不好有什么原因？
林瑞庆
偶尔也有这种情况，一是跟菌株的活力有关，长期存放的菌株有可能长不起来；另外可能跟菌株的纯化有关，如菌株不纯，有其他杂菌，会影响实验；还有就是厌氧环境，设备仪品和实验方法要尽量保证培养的厌氧环境。
网友
林老师，七种分型的多重PCR方法有么？
林瑞庆
七种毒素基因分型都有各自的引物。多重PCR有时效果并不好，已经报道有5种分型的多重PCR方法，我们扩增的效果是不如单独引物进行PCR，所以我认为七种分型临床应用没有必要做多重PCR，虽然能减少一些成本和工作量，但引物越多扩增效果影响越大，单独引物进行也是没有问题的，而且效果更好。
网友
林老师，刚才说的定期监测，能具体说一下吗？比如监测时机，看哪些指标等？
林瑞庆
禁抗后肠炎问题引起更多的关注，对于鸡来说，产气荚膜梭菌是主要的病原之一，肠道健康数据的收集调查对疾病的防控是非常重要的。至于鸡肠道健康监测，可以设置定期监测，对鸡群进行解剖评估，我们近年一直有进行这样的工作，定期（一般两个月）采集不同鸡场健康鸡只进行剖检，以球虫指标、肠炎指标等对肠道健康情况进行评估，禁抗前后也把产气荚膜梭菌的分离率指标引入，这是一个可量化的指标。除剖检评分外，养殖场普查或者可以定期采集新鲜粪便进行梭菌分离获得相应数据，作为一个评估肠道健康的指标，特别是提示慢性的坏死性肠炎。按照我们的经验，基本上分离的菌株都和肠炎相关，在禁抗前要分离到产气荚膜梭菌比较难，而现在明显肠炎的鸡只梭菌分离率较高。另外，如在生产上应用离子载体抗生素来防控球虫或产气荚膜梭菌的，梭菌的分离率会明显偏低。
网友
林老师，牛津杯法药敏实验，还需要表面覆盖无卵黄的TSC培养基吗？
林瑞庆
不需要，临床样品分离产气荚膜梭菌时才使用。
网友
林老师，牛津杯针对不同药品药敏实验，有抑菌但菌株不明显，菌株很薄，不密集是什么原因？
林瑞庆
这个可能和培养时菌株的增殖量有关，菌株的活力和纯度等因素影响，同样培养条件下有些梭菌实际浓度较低，可能做药敏试验时长的稀疏。
网友
林老师，药敏实验的菌不会产气正常吗？
林瑞庆
偶尔也会出现这种情况，大部分是正常产气，可能需要鉴定一下菌是否被污染了，如果排除了这个问题，我们也遇到过不产气的现象。
网友
林老师，现在肉鸡上能用的西药很少，未来肉鸡的用药方向在哪里呢？
林瑞庆
药物肯定还是疫病防控不可少的，但可以通过精细化管理、优质饲料还有品种的改良等减少药物的使用，未来将少用药用好药；除了通过科学防控方案进行疫病防控外，药物的效果还需更多工艺的研发，达到更好的效果，很多企业也都涉及了这方面的研究。像正典的抗寄生虫药虫力黑，原来需要连续几天用药，现在使用一次即可，还能降低毒性，这些都是通过工艺改进实现的。此外，替抗产品深入研究也能在疫病防控中取得良好作用。现在人们对食品安全越来越重视，而面对疾病又不可避免需要用药，只能不断努力改进药物和科学用药。
网友
林老师，定期使用酸制剂饮水，对本病的防控意义大吗？
林瑞庆
一些脂肪酸具有良好的抗菌活性，对肠道健康有一定的效果，对有害菌有一定的抑制作用，但对梭菌防控的意义大小不明确，如果从维护肠道健康的角度来说是有益的，维持肠道健康是防控本病的核心。
END