白血病基因诊断
作者简介：卢兴国，迪安诊断总部血液病实验室专家，原浙江大学医学院附属第二医院骨髓室负责人，国内知名形态学家，血液肿瘤多学科整合诊断专家。担任第四届至第九届中华医学会检验分会全国血液体液学学组委员，第三届中国微循环学会理事及多本杂志的编委等职务。致力于血液与骨髓细胞学和病理学诊断与研究四十六年，以第一完成人完成“四片联检在血液形态学中的临床应用”等获浙江省科学技术奖进步三等奖4项，浙江省高校科研成果二等奖1项，浙江省医药科技创新二等2项。共发表论文230余篇，主编专著17本。
基因诊断即分子诊断。通过分子技术可发现染色体畸变所累及的基因位置及其表达产物，检出细胞遗传学检查方法不能发现的异常，还能发现（尤其是核型正常者）癌基因突变、抑癌基因失活、凋亡基因受抑与DNA-染色质空间构型改变。一般所述的白血病基因检查（诊断），包含了四层意义：精细分类分型（特定类型）、解释发病原理、评估预后和指导治疗。
一、提供细分特定类型的诊断依据
在AML和ALL细分的特定类型（表1和表2）中，需要通过基因检查确认特定的融合基因（包括基因重排后癌基因异位高表达）和染色体异常，提供诊断依据。如AML的RUNX1-RUNX1T1（FAB分类的M2，少数为M4、M1）、CBFB-MYH11（M4，少数为M2等）、PML-RARα（M3）、MLLT3-MLL（M5，少数为M4）、RBM15-MKL1（M7）、DEK-NUP214（M2、M4），ALL的MLL重排、ETV6-RUNX1、IL3-IGH（癌基因异位高表达）、TCF3-PBX1等（表1、表2）。
表1. AML及相关前体细胞肿瘤分类类型（WHO，2017）
表2. 原始淋巴细胞白血病/淋巴瘤分类（WHO，2017）
（一）FAB分类形态学与基因诊断类型的关系
在FAB形态学诊断类型与染色体和基因诊断类型之间的关系见图1和图3。
（二）2017年WHOAML重现性异常类型与特定基因突变类型
2017年WHO修订的AML伴重现性遗传学异常分为AML伴平衡易位或倒位以及AML伴特定基因突变两大类（图4）。前者有8个类型，后者3个类型（表1）。这组特征是重现性遗传学异常，常为一开始便是（原发）AML，分子异常与形态学密切相关。一些急性白血病，遗传学检查核型正常，部分病例融合基因检查也为正常，但却检查出一些与细胞行为和患者预后有关的基因突变。与髓系肿瘤（主要见于AML）有关的突变除了RUNX1、NPM1和CEBPA外，还有FLT3、KIT、NPM1、RAS、DNMT3A、TET2和IDH1与IDH2等突变。常见的如FLT3基因突变，见于1/3核型正常的AML患者，可以预示不良预后；NPM1突变见于50%正常核型AML（核型异常者中只有10%~15%），FAB类型的M4（77％）、M5a（71％）、M5b（90％）都有高突变率，M3、M4Eo和M7则尚未检出突变；AML1（runt结构域）点突变见于M0和M7等。CEBPA突变约见于9％AML病例，但其中70％为正常核型，预后良好（图4）。
（三）AML特定类型的界定
AML伴t(8;21)(q22;q22.1)；RUNX1-RUNX1T1被界定为有t(8;21)(q22;q22)；RUNX1-RUNX1T1而形态学常显示粒系细胞成熟特征和临床预后良好的AML。融合基因RUNX1-RUNX1T1曾被称为AML1-MTG8和CBFα-ETO。AML伴inv(16)(p13q22)或t(16;16)(p13;q22)；CBFβ-MYH11被界定为有inv(16)(p13q22)或t(16;16)(p13;q22)；CBFβ-MYH11并有嗜酸性粒细胞增多的AML，即多为FAB分类中的AML-M4Eo，常见形态学特征为单核细胞和粒细胞的成熟以及骨髓存在异常嗜酸性粒细胞，故也称为伴异常嗜酸性粒细胞急性粒单细胞白血病（acute myelomonocytic leukaemia with abnormal eosinophils，AMML-Eo）。
APL伴PML-RARA被界定为有颗粒过多早幼粒细胞形态学特征以及分子遗传学具有PML-RARA融合基因的APL。t(15;17)(q22;q12)易位及其PML-RARA融合基因形成是APL的典型型。这一融合基因还可见于隐蔽易位或复杂的细胞遗传学重排。WHO（2016）为了强调该融合基因的意义，将有此融合的APL更名为APL伴PML-RARA。
AML伴t(9;11)(p21.3;q22.3)；MLLT3-KMT2A被界定为有t(9;11)(p21.3;q22.3)；MLLT3-KMT2A遗传学异常特征和常具有单核系、粒单系细胞形态学特征以及临床预后常差的AML。在2008版的WHO分类中，本型称为AML伴t(9;11)(p22;q22)；MLLT3-MLL。在2016更新分类中，将（mixed lineage leukemia，MLL）基因更名为赖氨酸甲基转移酶2A（lysine methyltransferase 2A，KMT2A）基因。
AML伴t(6;9)(p22;q34.1)；DEK-NUP214被界定为有t(6;9)(p22;q34.1)；DEK-NUP214遗传学异常特征，并与伴嗜碱性粒细胞增多和病态造血的M2与M4有一定关联，且临床预后常差的一种独立病种。
AML伴inv(3)(q21.3q26.2)或t(3;3)(q21.3;q26.2)；GATA2，MECOM，在2008版WHO分类中为AML伴inv(3)(p21q26.2)或t(3;3)(q21;q26.2)；RPN1-EVI1，由于RPN1-EVI1并非融合基因，而是远端的GATA2增强子重新定位而激活MECOM（EVI1）基因表达，同时使GATA2基因单倍不足。因此，在2016年WHO分类中更名为AML伴inv(3)(q21.3q26.2)或t(3;3)(q21.3;q26.2)；GATA2，MECOM。
AML（原始巨核细胞）伴t(1;22)(p13.3;q13.3)；RBM15-MKL1 AML伴t(1;22)(p13;q13)；RBM15-MKL1类型见于无唐氏综合征的婴儿AML，肝脾肿大明显，预后较差。外周血和骨髓中白血病细胞具有原始巨核细胞的形态特点，MPO和SBB阴性，CD41、CD61和CD42阳性。部分患者伴骨髓纤维化，且原始细胞可不见明显增高。可表现为软组织肿块（髓系肉瘤），类似其他蓝色圆形小细胞肿瘤。
AML伴BCR-ABL1 AML伴BCR-ABL1是新增的伴重现性遗传学异常的临时病种，为罕见的原发类型，可以受益于酪氨酸激酶抑制剂治疗。患者脾肿大和嗜碱性粒细胞增多较CML急变者少见，细胞增生性也略低些。本型AML需要与CML急变相鉴别，IKZF1和（或）CDKN2A缺失和IGH、TCR基因内隐蔽的缺失，可以支持原发AML的诊断而非CML急变期。
（四）ALL特定类型与FAB形态学
原始淋巴细胞白血病（ALL）/淋巴瘤，WHO分类中，将前B淋巴细胞（B 原始淋巴细胞）肿瘤和前T淋巴细胞（T原始淋巴细胞）肿瘤一起归类为原始淋巴细胞肿瘤类型。
原始淋巴细胞肿瘤有3个类型，见表2。B原始淋巴细胞白血病/淋巴瘤又有两个类型：不另作特定分类型（NOS）和细分的特定类型（伴重现性遗传学异常类型）。B原始淋巴细胞白血病/淋巴瘤，NOS，为伴重现性遗传学异常外的B系ALL/淋巴瘤，形态学为基本诊断，免疫表型为B、T系列确认检查，但不需要免疫表型的进一步细分。B原始淋巴细胞白血病/淋巴瘤伴重现性遗传学异常类型，在形态学和免疫表型检查的基础上，需要遗传学和（或）基因检查进行细分的特定类型诊断（表2和图5）。
在急性白血病中还有更多的细胞遗传学与分子异常（基因表型，包括融合基因与重排后癌基因异位高表达），由于用于疾病定义的价值，或异常特征的特异性或公认性，均未被WHO用于特定类型分型中，仅供参考和研究。这些形态学、遗传学与分子学的表型有FAB分类M0、M2的[t(10;11)(p13;q14)；CAML-AFIO]、M5的[t(8;16)(p11;p13)；MOZ-CBP]等。
图1. AML-M1和M2（FAB）及细分特定类型（WHO）的诊断
ANC为有核细胞分类，NEC为非红系细胞分类，AML1-MTG8又称RUNX1-RUNX1T1；分类出特定类型（较少）后的为AML，NOS（较多）；*有典型形态学特征者可以提示相应的遗传学和基因异常
图2. AML-M4和M5（FAB）及细分特定类型（WHO）的诊断
*有典型形态学特征者可以预示相应的遗传学和基因异常；**为单核系细胞分类
图3. 急性早幼粒细胞白血病（FAB）及细分类型（WHO）对维A酸的敏感性
*有典型形态学特征（密集颗粒、棒状Auer小体和胞体胞核改变早幼粒细胞）可以预示相应的遗传学和基因异常
图4. AML伴重现性遗传学异常类型与形态学类型的关系
红线示两者强相关，黑线和绿线示该重现性遗传学异常常见于和少见于对应的形态学类型。黄色长方形中的类型为重现性遗传学异常。圆角矩形中类型表示形态学诊断的基本类型；绿色者与一种伴重现性遗传学异常强相关，无相应的非特定类型（见表1）。*示该类型白血病原始细胞可低于20%。
图5. ALL（FAB）和细分的特定类型（WHO）诊断
*典型形态学特征者可以提示免疫表型和细胞遗传学与基因异常
二、解释发病原理
对白血病等造血和淋巴组织肿瘤发病机制（分子病理）的深入了解，诸如慢性淋巴细胞白血病（CLL）、慢性粒细胞白血病（CML）和真性红细胞增多症（PV），在血液和骨髓中的异常细胞均有凋亡途径障碍所致的蓄积性机制参与；MDS和MA则是存在细胞凋亡过多的疾病。在细胞通迅和识别等应答中的信号转导（signal transduction）失控而引起的细胞增殖、细胞骨架重排和转化、细胞凋亡障碍是促发白血病等造血和淋巴组织肿瘤发生的又一原理，如慢性粒细胞白血病被认为是致癌性BCR-ABL融合蛋白（非受体型酪氨酸激酶）使底物酪氨酸残基持续磷酸化，使核内靶基因转录增强而促发；细胞凋亡理论指导的实践又让我们认识一些造血和淋巴组织肿瘤（如Burkitt细胞白血病，即FAB分类的ALL-L3）高增殖和高凋亡的细胞学特征以及肿瘤性凋亡细胞的形态；受体型酪氨酸激酶癌性蛋白（如原癌基因KIT突变和FIT3突变）均可经细胞膜受体使下游信号转导途径持续激活而促发造血和淋巴组织肿瘤；细胞因子介导的细胞内信号转导异常，如细胞膜受体对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）特别敏感，持续激活RAS-MAPK和JAK-STAT信号转导途径被认为是促发幼年型慢性粒单细胞白血病的分子病理。又如急性白血病发生的分子病理，除了基因突变外，有两个分子类型（图6）：融合基因型（fusion gene type）和转录调控异常型（transcriptional disregulation type）。AML的发生，多是染色体易位、基因重排导致癌基因与易位处的某个基因形成融合基因，抑制了正常调控的靶基因功能而导致细胞增殖失控、分化成熟和凋亡障碍，涉及这组原癌基因（proto-oncogene）与伙伴基因（partner gene）形成的融合基因有AML1-ETO（AML-M2）、PML-RARα（AML-M3）、CBFβ-MYH11（AML-M4）、DEK-CAN（AML-M2、AML-M4）、MLL-AF9等；而ALL的发生则多是染色体易位、基因重排导致原本处于相对静止状态的原癌基因激活而过度表达（癌基因异位高表达），使细胞失控而增殖和转化，涉及这组原癌基因有MYC（ALL-L3）、TAL1、LYL1、TTG1和TCL3（T-ALL）等。
图6. 染色体易位基因异常的两个主要类型与急性白血病的发生
白血病中，基因产物高表达是分子病理的一个形式，对于预后和诊断也有参考意义。常见扩增基因有MYC、BAALC、MN1、ERG、WT1、TAL、TTG、TAN、LYL等。APL、ALL-L3和CML急变等，都可见MYC基因扩增，与细胞高周转相一致。ALL（T系）的TAL、TTG、TAN、LYL等都是染色体易位基因并置时，原癌基因被激活而在异位的高表达，是白血病/淋巴瘤的促发因素。
三、评估预后
预后方面评判。在诊断时，遗传学所见是除了年龄因素外评判治疗反应性、复发危险性和总生存率的最重要指标。遗传学分析习惯于根据对治疗的不同反应把患者分成不同危险组。例如，对于核心结合因子突变的预后良好组患者，用大剂量阿糖胞苷巩固后最有可能获得长期缓解；而不良预后的细胞遗传学患者对这一治疗无效。约40％~50％患者诊断时为正常核型，属于异质性的中危组。AML细胞遗传学和分子学改变进行预后危险度判定见表3和表4。
表3. 细胞遗传学正常AML中发现的预后关联基因突变
表4. 急性髓细胞白血病患者预后危险度分级
四、指导治疗
在临床上，血液肿瘤分子学的应用还在于治疗上的指导意义，提供最直接的分子靶向治疗（molecularly target-based therapy，molecularly targeted therapy）的依据，譬如1996年开发的竞争性抑制BCR-ABL1等非受体型酪酸激酶活性癌性蛋白与ATP的结合，封闭底物酪氨酸残基磷酸化的STI571（Imatinib，Glivec），以及新的靶向药物酪氨酸激酶抑制剂——Rydapt（midostaurin）治疗伴FLT3-ITD的AML，都具有划时代意义的代表性靶向药物；组蛋白脱乙酰化酶（histone deacetylase）与AML1-ETO（RUNX1-RUNX1T1）、PML-RARα等组成的复合物参与白血病的形成，为另一类白血病的分子病理，即组蛋白的乙酰化（histone acetylation）与脱乙酰化化学修饰过程，开发的组蛋白脱乙酰化酶抑制剂通过促进组蛋白乙酰化激活转录而抑制白血病的增殖、诱导细胞成熟和凋亡（图7）。如在Ph阳性ALL的一线治疗方案中，联合酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）如伊马替尼和达沙替尼已成为标准治疗。然而，TKI治疗耐药的出现是原发难治性或含TKI方案初始治疗后复发的病人的挑战。有些伊马替尼耐药ABL突变对新的TKI不敏感，如达沙替尼对包含ABL T315I、V299L和F317L突变的细胞没有活性，因此需要用分子学技术鉴别出可能对治疗耐药的ABL突变。
图7. 抗肿瘤新药的分子靶位点
金黄色背景方框内为靶向药物，绿色椭圆形表示各种信号转导分子；HDAC为组蛋白去乙酰化酶；DNMT为DNA甲基转移酶
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