文献解读 | 家蚕前pRNA 3‘Trimmer的鉴定及功能分析
论文：Identification and functional analysis of the pre-piRNA 3′ Trimmer in silkworms（家蚕前pRNA 3‘Trimmer的鉴定及功能分析)
摘要
在动物生殖细胞转座子沉默中，Piwi相互作用的RNA(PiRNAs)起着至关重要的作用。在pIRNA生物发生过程中，单链pRNA中间体被装载到PIWI-clade蛋白中，并被西葫芦/MitoPLD切割，产生前体piRNAs(prepar-piRNAs)。
然后在它们的3‘端修剪比成熟的piRNA长度更长的pRNAs。虽然最近的研究表明，Tudor结构域蛋白Papi/Tdrkh参与了pAPI/Tdrkh的前papi/tdrkh，但Trimmer的同一性及其与Papi/Tdrkh的关系尚不清楚。
在这里，我们确定了PNLDC 1，一种未表征的3‘-5’外显子酶，是蚕中的Trimmer。修剪器在线粒体分数中富集，并与Papi/Tdrkh结合。
Trimmer和Papi/Tdrkh的耗竭会额外抑制剪裁，导致35-40 nt的前piRNAs积累，这对靶子的切割有损害，而且容易降解。我们的结果突出了Trimmer和Papi/Tdrkh在piRNA成熟过程中的协同作用。
微调活性在线粒体组分中富集
(A)亚细胞分离BmN 4细胞的Westernblot分析。各组分中总蛋白含量相等。组蛋白H3、α-微管蛋白和Tom20分别作为细胞核、细胞质和线粒体的分数标记物。
将线粒体粗分进一步分离为MAM-mito、Pure-mito和MAM组分.Mam，线粒体相关膜；Lyso/PM，溶酶体和质膜；ER，内质网。线粒体富集组分呈红色。BmPapi和trimmer在含线粒体的组分中富集。
(B)用蛋白浓度相等的BmN 4细胞裂解液进行体外微调试验。线粒体组分具有较高的微调活性。
(C)用10-35%蔗糖密度梯度离心法分离BmPapi旗稳定细胞的CHAPS溶解粗线粒体(粗MITO)组分。每组分(顶板)进行体外微调试验。
用Westernblotting(中间板)分析BmPapi和Trimmer的分布。总蛋白水平在每个分数显示(底部面板)。BmPapi和Trimmer的分布与修剪活性密切相关。具有高微调活性的馏分用红色表示。
(D)以幼稚的BmN 4或BmPapi标志稳定细胞为原料，经抗标志抗体免疫沉淀，制备出解溶的线粒体粗蛋白(粗-mito)组分。体外微调实验采用CHAPS溶解粗米托组分(IP输入，左面板)或标志免疫沉淀(右面板)。BmPapi旗复合体具有明显的修剪活性。
(E)用SDS-PAGE法对免疫修饰的BmPapi标志复合物进行SDS-PAGE分析，并用Oriole荧光凝胶染色剂对其进行染色。质谱鉴定的4种3‘-5’外核酶在BmPapi-标志复合物中呈红色。
(F)为Trimmer候选基因转染BmN 4细胞。1,000×g颗粒组分进行体外微调试验。对于BGIBMGA 003312，使用了两种不同的dsRNA(#1和#2)。模拟显示转染dsRNAs的BmN 4细胞雷尼拉荧光素酶。只有BGIBMGA 006602的基因敲除使修剪活性降低，类似于BmPapi基因敲除。
PNLDC 1是家蚕前piRNA 3‘-微调酶的三聚体
为了确定这四种外核酶中哪种是Trimmer，我们接下来用dsRNAs敲除了每个核酸酶，并考察了其对体外微调活性的影响。引人注目的是，BGIBMGA 006602(PNLDC 1：poly(A)-特异性核糖核酸酶(Parn)样结构域包含1)的敲除对微调活性没有明显的抑制作用。
PNLDC 1是属于CAF 1超家族的一种未表征的3‘-5’外显子酶。PNLDC 1的核酸酶结构域与BmPARN的同源性为29%，但在C端有一个附加的跨膜结构域。PNLDC 1在小鼠和人类中似乎是保守的；然而，在苍蝇、蠕虫和斑马鱼。
pRNAs的3‘延伸和减少
(A)用dsRNA转染BmPapi和/或Trimmer稳定细胞。用抗旗标抗体免疫沉淀细胞提取物。免疫沉淀用Westernblotting(上板)分析，结合RNA用5‘32去磷酸化后P标记(下板)。
微调或BmPapi敲除导致Siwi-和BmAgo3结合的pRNAs的延伸。此外，BmPapi基因敲除降低了PIWI蛋白和pRNAs的丰度。
(B)BmPapi和/或Trimmer基因转染BmN 4细胞。提取总RNA，用Northern印迹法检测pRNA-1和piRNA-2。莱特-7以miRNA作为负载对照。BmPapi和/或Trimmer的基因敲除使这两种pRNAs的长度延长。BmPapi和Trimmer的双重敲除积累了可能的前piRNAs(箭头)。
(C)将表达催化活性(E30A)Trimmer的质粒转染旗-Siwi或标志-BmAgo 3稳定细胞。细胞裂解液经抗标记抗体免疫沉淀。免疫沉淀用Westernblotting(上板)分析，结合RNA用5‘标记法检测。
32P(下面板)。模拟显示转染空质粒的BmN 4细胞。催化活性(E30A)Trimmer的过度表达导致了pRNAs的延伸。
(D)将表达催化活性(E30A)Trimmer的质粒转染BmN 4细胞。模拟显示转染空质粒的BmN 4细胞。用Westernblotting(上板)或Northern blotting(下板)提取和分析整个细胞裂解物和总RNA。
莱特-7用miRNA作为Northernblotting的负载控制。催化活性(E30A)Trimmer的过度表达导致了pRNAs的延长和推测的前piRNAs(箭头)的积累。
(E，G)在BmPapi和Trimmer双重敲除下定位到1,811个转座元件的~25~45 nt文库(E)或~35~45 nt文库(G)的pRNAs长度分布。读取被规范化为完全映射读取。BmPapi和Trimmer基因敲除增加了pRNAs的长度分布。
(F，H)在BmPapi和Trimmer双敲作用下，从~25~45 nt文库(F)或~35~45 nt文库(H)定位到1,811个可转座元件的pRNAs的5‘和3’变异分析。
计算了每个pRNA位点3‘和5’端位置的模式值，并指出了它们在每个长度中所占的百分比(见图S4A)。BmPapi和Trimmer的敲除在pRNAs的3‘端延伸。
讨论
通过抑制修剪，我们检测到~(35-40)nt前pRNAs的积累，与成熟的piRNAs相比，pRNAs的3‘端延长。深入测序分析表明，Pre-piRNAs在幼稚的BmN 4细胞中存在较低水平，但在BmPapi和Trimmer的双重敲除作用下更显着。
在苍蝇和老鼠中，前pRNAs的3‘端是由小西葫芦/mitoPLD介导的下游U残基切割，或通过piRNA引导在另一个邻近的乒乓位点切片来定义的。
我们已经发现证据表明，至少有一部分家蚕预-piRNAs有U下游偏见，就像苍蝇和老鼠的前piRNAs(K.S.，N.I.，Y.T.和S.K.，未公布的数据)。
此外，最近的一项研究表明，bmAgo 3的靶切割可从ppong pong pna的靶转录子下游在bmN 4细胞，表明前pRNA产生机制在物种间是保守的。
然而，前piRNA长度有明显的差异；蚕体内的前piRNAs长度与小鼠中的piRNAs长度相似(~30-40 nt)，但远长于蝇类，后者的前piRNAs平均只比成熟的piRNAs长0.35-nt。这种前iRNA长度的差异可能与核酸酶主要用于3‘端修剪有关。
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