师姐真传的一些RNA抽提技巧（TRIzol法）

1、使用前防范：TRIzol剧毒且易挥发（由于主要成分是苯酚），氯仿呢也是一种有毒也易挥发的试剂，有的小盆友为了防止氧化，还会加入β巯基乙醇，这个反正建议有鼻子的童鞋都做好防护。提取RNA前做好保护措施，最好在通风厨中操作，所有接触TRIzol的耗材，最好扔到专门的密封的桶中，等待处理。否则整个实验室都会弥漫着气味，师兄师姐会打死你的！

2、必备前奏：所有耗材（枪头、EP管）均经过RNA酶灭活或者直接购买无RNA酶的耗材，除RNA酶主要方法是用DEPC水浸泡48小时（DEPC虽然味道香，但却是强致癌的，泡管子的时候别一直去闻它，一般来说煮沸或高温高压灭菌15min后，DEPC就会降解成二氧化碳和水）。顺便说一句，其实我们以前也曾经试过，湿热灭菌两次，也可以有效降低RNase，当然这是偷懒的办法啦。操作前戴口罩，你的唾沫星子是最大的RNA酶来源。

3、RNA非常容易降解，所有步骤尽量在冰盒里面操作，包括离心时需用4度预冷的离心机。根据说明书，非特别注明，所有程序均在15-30度下进行，试剂也放置于15-30度，但是都不是温度计的大家，还是放在冰盒上靠谱点。

4、1-5×10^7细胞或者50-100mg组织加入1ml TRIzol，细胞或者组织过多，TRIzol过少会导致裂解不充分，内源性RNA酶抑制不完全，导致RNA降解。

5、TRIzol加入细胞后，反复吹打，充分裂解细胞至均一透亮，不粘稠为止。

6、加入氯仿后充分混匀，其实这步也不能过于剧烈，上层的水相含有RNA，中间的组织相含有DNA和蛋白质，剩余的一部分DNA会萃取到氯仿中，同时氯仿具有使蛋白质变性的作用，离心完，中间那层就是组织层。

7、离心后，溶液分层，上层为含有RNA的水相，中间层乳白色的为含有部分DNA、蛋白质的组织层，下层红色的为含有DNA和部分蛋白质的氯仿, 此时，注意，“宁少勿多”，提取上层无色液体时，小心轻柔，可以用200ul的枪抽吸，一般1ml的TRIzol时最多可以提取500ml上清，但是建议提取400ul以下，千万避免吸到中间的乳白色组织层，否则最后测量RNA时，OD260/280非常低，会有蛋白混入。

8、异丙醇加入的目的是为了使RNA沉淀，此时RNA已经提出来了，应轻轻混匀，避免RNA损伤。离心后肉眼可见EP管底部白色羽毛状沉淀即为RNA沉淀，后面洗涤等操作均应该注意，切勿将白色沉淀给倒掉，否则你就白提了。

9、75%乙醇加入的目的是为了洗涤和沉淀作用，也应该轻柔。

10、最后晾干乙醇时应尽量充分晾干，先用枪头尽量把75%乙醇吸干，再晾5min,否则没有晾干乙醇，加入DEPC水时可能导致RNA白色沉淀不溶解。

11、加入DEPC水溶解RNA时，可根据自己需要的浓度来调整加入DEPC水的量。

12、纯的RNA的OD260/280为2.0，比值在1.8~2.0为较好结果，<1.8提示有蛋白蛋白参杂，>2.0说明RNA有降解。

13、RNA提取后可以跑琼脂糖胶来判断降解情况，纯的无降解的RNA跑完琼脂糖胶后应该有3条带，26S，18S， 5S。其中5S很淡，不容易看见。如果条带很淡，且有拖尾现象，提示有RNA降解。