乳腺癌患者抗PD1治疗期间肿瘤内变化的单细胞图谱
文章信息
题目：A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer
时间：2021年5月
期刊：Nature Medicine(IF: 36)
DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-021-01323-8
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免疫检查点阻断（ICB）联合新辅助化疗可改善乳腺癌（BC）的病理完全反应，本文研究为什么只有一部分肿瘤对 ICB 有反应。激素受体阳性或三阴性乳腺癌患者在手术前接受了抗 PD1 治疗，作者对接受抗 PD1 治疗的初治患者（n = 29）或抗 PD1 治疗前接受新辅助化疗的患者（n = 11）的治疗前与治疗中活检样本进行单细胞转录组、T 细胞受体和蛋白质组分析。结果表明三分之一的肿瘤含有表达 PD1 的 T 细胞；无论肿瘤亚型如何，这些 T 细胞在抗 PD1 治疗后都会克隆扩增，扩增主要涉及具有明显细胞毒活性（PRF1、GZMB）、免疫细胞归巢（CXCL13）和耗竭标志物（HAVCR2、LAG3）的 CD8+ T 细胞，以及以 T-helper-1 表达为特征的 CD4+ T 细胞（IFNG)和滤泡辅助 (BCL6, CXCR5) 标志物。在治疗前活检中，免疫调节树突细胞 (PD-L1+)、特定巨噬细胞表型 (CCR2+ 或 MMP9+) 和表现出主要组织相容性复合体 I/II 类表达的癌细胞的相对频率与 T 细胞扩增呈正相关。相反，未分化的前效应/记忆 T 细胞TCF7+、GZMK+）或抑制性巨噬细胞（CX3CR1+、C3+）与 T 细胞扩增呈负相关。总的来说，作者的数据确定了与抗 PD1 治疗后 T 细胞扩增呈正相关或负相关的各种免疫表型和相关基因组。阐明了乳腺癌中抗 PD1 治疗反应的异质性。
样本信息
第一组（初治早期BC）的 29 名患者和第二组（接受新辅助化疗的 BC）的 11 名患者。
单细胞测序技术
scRNA-seq(10x Genomics) , scTCR-seq和CITE-seq
部分分析结果
抗 PD1 治疗前和治疗期间的单细胞分析
由scRNA-seq从第一组患者队列中获取了29对治疗前和治疗期间的高质量活检数据，涉及175,942个细胞，平均每个细胞检测到1,759个基因。随后的分析确定了分群：恶性乳腺上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞（如上图）。
使用scTCR-seq方法，在51499个T细胞中定义了基于共享TCR序列的克隆型，共确定了9例在治疗前与治疗期间在两个阈值（>2或>5）上的克隆型扩张患者（如下图）
表达PD1的T细胞在抗PD1治疗后扩增
作者分析了T细胞扩增(E vs NE)和治疗(治疗前vs治疗期间)分层的scRNA-seq数据。发现经过治疗后，NEs中成纤维细胞较多，Es中T细胞较多（如图d）。在治疗期间，癌细胞和成纤维细胞在NEs中更常见，而T细胞在Es中进一步富集。
作者通过对T细胞进行亚聚类（如图e），发现一个CD8 +及CD4 +细胞簇表达PD1（如图f），表示免疫检查点标志物（LAG3, HAVCR2, PDCD1）、效应(IFNG, NKG7)标志物和细胞毒性标志物 (GZMB, PRF1) 都表达的具有耗竭样的活化T细胞。作者将这种细胞称为经验T细胞（TEX细胞）。
拟时序分析结果
三种不同的CD8+ T细胞轨迹。TN连接到TEM细胞，TEM细胞分叉成三种不同的轨迹，形成TEX1和TEX2细胞、滞留记忆CD8+ T细胞(TRM)和激活效应/记忆T细胞(TEMRA细胞)。
在CD4+ T细胞(TREG除外)中，发现了额外的表型异质性。经验丰富的TEX细胞分裂为1型辅助细胞(TH1)和滤泡辅助细胞(TFH)
T细胞扩增过程中基因表达的变化
作者沿着 CD8+ TEX 轨迹确定了五组差异表达基因 (DEG)。由初始 T 细胞标记物（CCR7、LEF1）组成的第一组沿着轨迹下降，而两组由（早期）激活基因（GZMK、GZMM、GZMA、NKG7）组成，在轨迹中途增加，但随后下降。另外两组在轨迹结束时增加，并以效应子（IFNG）、细胞毒性（GZMB、PRF1）、早期和全身衰竭（PDCD1、CTLA4、ENTPD1；图 a）标记为特征。在每个基因组中，作者鉴定了几个以前未被鉴定为 T 细胞标记的基因（例如，INPP5F 和 GPR25 作为分化的 TEX 标记，图 a）。尽管轨迹将具有相似表达的细胞分配到相同的拟时序，但作者观察到一些基因在 E 和 NE 轨迹之间差异表达。例如，效应子和细胞毒活性相关基因（PRF1、GZMB、IFNG）、CTLA4 和 TOX2 在 Es 中始终较高（图 b）。RUNX3 及其辅因子 CBFB，它们在 NE 中减少（图 b）。通路分析揭示了干扰素（IFN）反应的上调和 Es 中氧化磷酸化的下调（图c、d）。沿着 CD4+ TH1 轨迹，作者在比较 Es 与 NE时类似地确定了五个基因集（图e）和 499 个 DEG，包括潜在的 TH1 标记，如 ZEB2（图f）。与 CD8+ T 细胞类似，NEs 中 RUNX3 和 CBFB 减少，而 Es 中 IFN-α/γ 反应增加（图 f-h）。因此，沿着轨迹的基因表达谱确定了在 Es 和 NEs 之间差异表达或激活的标记或途径。
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总结
这篇文章评估了接受ICB的乳腺癌患者的肿瘤内变化。分析的是来自配对的治疗前（接受抗PD1治疗的29名初诊患者）和治疗期间（抗PD1治疗前接受新辅助化疗的11名患者）的单细胞转录组、T细胞受体和蛋白质组数据。发现三分之一的肿瘤含有表达PD1的T细胞，不论肿瘤亚型如何，抗PD1治疗后T细胞可克隆扩张。总的来说，文章的数据确定了各种免疫表型和相关基因集，它们与抗PD1治疗后的T细胞扩张呈正相关或负相关，揭示了乳腺癌中抗PD1治疗反应的异质性。