精彩远不止m6A！这篇没有湿实验的27分 文章提出了近乎完美的模型
RNA的修饰广泛存在于腺嘌呤A、尿嘧啶U、胞嘧啶C、鸟嘌呤G四种核糖核苷酸上，有超过170种，A是 RNA 上被修饰最多的碱基，其中有四种最常见的修饰：
①RNA的m6A修饰：
RNA 碱基 A 第六个氮原子处的甲基化。它是最丰富的内部 RNA 修饰形式，影响 RNA 稳定性和翻译效率。m6A的存在可引起细胞生理过程的变化，并在病理状况中起关键作用，包括癌症的发展
②RNA的m1A修饰：
m 1 A的修饰会影响腺嘌呤碱基的第一个氮原子，并在生理条件下带正电荷。它在调节基因表达和控制细胞命运方面具有重要作用，从而影响疾病的发生和发展
③选择性多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）：
APA 是一种 RNA 加工机制，可在不同位点切割 mRNA 并添加多聚A尾，以生成包含不同长度的 3'-非翻译区或编码区的转录本，与高度增殖的肿瘤相关。
④腺苷到肌苷RNA编辑（A-to-I编辑）：
A-to-I 编辑可以改变蛋白质中的氨基酸序列并影响其他转录过程，从而通过对肿瘤相关基因的位点特异性修饰来促进肿瘤发生和肿瘤进展。
这几种修饰之间存在竞争性补偿作用，如m6A 修饰相关编写酶“writer”可以负性调节 A-to-I 修饰，因此本文作者专注研究上述四种RNA修饰，这些修饰主要被“writer”介导。
1、结直肠癌中基因和转录水平的RNA修饰writer 改变【差异筛选】
为了确定癌症中RNA修饰的遗传改变，作者对TCGA数据库中404个样本进行突变频率的计算，发现119 个（29.46%）具有 RNA 修饰相关酶“writer”的突变。具有这些突变的患者生存预后更差。与正常样本相比，“writer”的表达在结直肠癌中升高。
上述数据提示：正常样本和结直肠癌样本之间的遗传特征和RNA 修饰相关酶“writer”的表达存在高度异质性。
2、RNA 修饰的模式及生物学特性【分群特征描述】
为全面了解“writer”的特征，作者通过单变量Cox回归分析确定有10个RNA修饰“writer”和预后相关。相关性分析发现不同类型的“writer”之间存在显著的相关性。接下来作者使用无监督聚类方法和GSVA富集分析，将上述“writer”分为两个类型：Cluster_1和Cluster_2：Cluster_1致癌信号通路激活，如 ECM 受体相互作用、TGF-β 信号通路和细胞粘附等，表明这类“writer”可能与肿瘤发生有关。Cluster_2预后更好，增殖和凋亡相关通路激活，包括细胞周期的激活，DNA复制，和错配修复途径等。
为比较“writer”修饰模式和免疫细胞成分差异，作者使用CIBERSORT 方法（一种用向量回归确定肿瘤免疫细胞类型的反卷积算法）观察到Cluster_1亚群中，M2巨噬细胞、T调节细胞、T滤泡辅助细胞比例更高，Cluster_2亚群中活化的树突状细胞、自然杀伤细胞和 M1 巨噬细胞比例更高。提示RNA修饰模式影响特定免疫细胞的浸润，Cluster_1亚群与免疫受到抑制相关。
3、构建RNA修饰特征印迹【验证评分模型】
为进一步确定两种RNA修饰亚型的功能，作者对463个与RNA表型相关的差异基因进行富集分析，再次进行无监督聚类（划分为gene.cluster_A 和 gene.cluster_B）并与之前的亚型相关联（gene.cluster_A关联Cluster_1），（gene.cluster_B关联Cluster_2）,随后巧妙的构建评分模型“WM_Score”来量化结直肠癌患者的RNA修饰模式。Cluster_1 WM_Score评分高，而WM_Score评分高与M2巨噬细胞、T调节细胞、T滤泡辅助细胞浸润呈正相关，且患者生存预后较差。提示WM_Score评分模型反映 RNA 修饰模式并预测结直肠癌患者的预后。
4、结直肠癌的分子分型与 WM_Score 相关【模型的临床意义】
目前结直肠癌具有四种分子分型（CMS1-4），为确定WM_Score与分子分型的关联，作者比较GEO和TCGA队列中各个分子分型的WM_Score得分情况，发现CMS4 亚型在 WM_Score高评分组更常见，而 CMS1/2 亚型在 WM_Score低评分组中占主导地位。肿瘤TNM分期越高，WM_Score评分越高。表明WM_Score与CMS亚型密切相关，高评分可能与预后差相关。
5、与WM_Score相关的转录和转录后特征【调控机制】
WM_Score是作者基于26个RNA修饰“writer” 提出的预测模型，而这些“writer”涉及到RNA转运、定位、修饰和其他生物过程，为进一步评估该模型在上述生物学过程中的特点，作者首先分析WM_Score 高评分和低评分组之间 miRNA 表达差异，发现WM_Score 与 miRNA 表达和信号通路的调节有关。大多数与缩短APA（Shorting）的基因都富集在WM_Score低评分组中，与较差的预后相关。
6、WM_Score与免疫治疗药敏及疗效的关系【模型的临床意义】
因为WM_Score与肿瘤的免疫微环境相关，作者找到两个免疫治疗队列，用WM_Score评分系统预测患者对免疫治疗的反应力，发现疾病完全缓解患者的评分低与其他患者。而且WM_Score低评分组的肿瘤突变负荷和肿瘤抗原负荷显着高于WM_Score高评分组，高评分组中M2巨噬细胞的活化和基质细胞的肿瘤浸润更高，可能与肿瘤的免疫耐受有关，更容易成为PDL1疗法耐药的“冷肿瘤”类型。
上述结果可能有利于制定结直肠癌免疫治疗策略。
作者首次对1697年以来的结直肠癌GEO和TCCA数据库中的与RNA修饰相关的研究数据进行了全面的分析，目光不止聚焦在m6A，还包含了其他三种常见的RNA修饰。
通过相关分析、无监督聚类、单因素和多因素Cox回归分析等方法，构建RNA基因表达的评分模型，区分出亚型，多角度验证这个评分模型与免疫微环境、临床分子分型和免疫治疗疗效相关。
本文生信和临床结合得非常精巧，既有大数据分析的有效证据，也有临床生存分析的应用指导价值，是一篇值得思考借鉴的好文章！