液相色谱“双峰”的原因,看这里!
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色谱双峰指的是明明是同一种物质,但在色谱图中却呈现双峰,让实验人员误认为含有两种物质。那么,出现双峰的原因主要有哪些呢?今天小析姐就和大家聊一聊,液相色谱出现“双峰”的原因。
在HPLC分析中,在色谱柱正常,样品浓度适宜,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下,峰型应对称而尖锐。但在实际操作中,如果对样品不了解,前处理不恰当或者分析方法不合理等,会出现峰形不正常的情况,其中双峰现象就是液相色谱中常见的问题之一。
色谱柱
如果在样品分析时发现每个色谱峰都有双峰出现,尤其在采用单一纯物质时,则可以确定是色谱柱出现问题了,一般是柱头受损或者柱头固定相污染引起的。
溶剂问题
目前HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解,最佳的溶解方法是用流动相溶解。在实际分析中,有时候为了样品的溶解性或稳定性加入了一点的缓冲液,缓冲液的酸碱性可能会导致样品转化,从而产生双峰现象。此时需要更换缓冲液,调整溶剂pH值,或者用流动相配置样品。
进样量
当用溶剂极性强度大的试剂,如纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主时,如果样品进样量大,如定量管为20ul,此时单一的纯物质会出现双峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的,此情况下需要减少进样量。
样品特性
有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时,在一个特定的条件下(如pH值、流动相极性、温度等),一种物质将出现双峰,双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其pH,双峰现象将消失,如红霉素等。
pH值
体系pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上(前面已经提到),尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响更为明显。当连续进样时,受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外,在样品分析时,流动相的pH尽量远离被分析物的等电点,否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试剂分析时,选择不好条件也会容易引起双峰的产生。
HPLC分析中,在色谱柱正常,样品灵敏度足够,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下(不包括梯度),峰型应对称而尖锐。但是,在对样品了解程度不够,方法不妥,样品处理方法及进样方式不合理下,会出现各种意想不到的问题,而对色谱峰难以作出合理的解释,尤其对于新手更是如此,所以,了解每种鬼峰出现的原因对我们的分析工作是非常重要的。