日问152：二代测序在神经系统感染中的作用？
“ 二代测序在神经系统感染中的作用？”
一、经典方法
经典的病原学检测方法主要包括细菌、真菌培养、
镜检和抗体检查，
基于PCR的病原特异核酸检测
缺点：诊断灵敏度仍较低，时效性差，病原体鉴定信息和耐药信息不全面，且对于未知或少见、罕见的病原微生物，无法进行识别。
但感染性疾病的病原种类繁多，传统的免疫学检测及病原微生物培养等手段，在鉴定感染性疾病的病原方面耗时、费力，难以及时地为临床提供可靠的诊断依据，使不少感染性疾病患者未能得到及时、有效的治疗，导致其预后不良。
二、关于二代测序
二代测序技术（next generation sequencing，NGS）又称为下一代测序技术和高通量测序，其可一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，是一组较一代测序通量更高、成本更低、用时更短且自动化程度更高的测序技术。因其可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。
三、二代测序的优势
目前估计有30%-60%的脑炎病例即使经过全面深入的检查，仍然无法明确其病因。
使用NGS检测可诊断病毒性（DNA病毒和RNA病毒）脑炎。
使用DNAse可以通过降低人源化核酸的背景，从而显著提高病原微生物的检出率（30-50倍）。
使用NGS检测时，可以在完全没有先验信息或者临床倾向性的时候检测到病原，因此可对于少见、罕见感染或者新发的感染性病原体进行检测。
基于宏基因组的NGS检测，还可识别一些此前未知的可以引起人类疾病的病原体
NGS检测可以诊断出一些罕见的、新发的或者不典型的病原微生物，如钩端螺旋体、星状病毒、古细菌、博尔纳病毒等，从而深化人们对神经感染性疾病的认识
四、面临的问题
1.灵敏度有限：
首先存在的问题是灵敏度，尽管NGS检测在诊断少见、罕见病原体方面展现了优于传统方法的巨大实力，但对于常见的结核分枝杆菌、隐球菌等病原体，其灵敏度并不强于传统方法
对部分抗酸染色或GeneXpert检测结果阳性确诊的结核性脑膜炎患者，NGS仍然只能在其脑脊液内检测到少量或根本没有检测到结核分枝杆菌的片段。目前对临床标本直接进行NGS检测来诊断结核分枝杆菌感染难度很大，而作为替代，往往是将临床标本进行结核培养后再进行NGS检测，以此提高临床标本检测的阳性率。
对于一些存在机体免疫反应进而引起损害的感染性（后）脑炎，如乙型脑炎，主要依靠血清学检查检测患者体内的乙型脑炎病毒抗体来诊断，即使最灵敏的RT-PCR检测也只能在10%患者脑脊液内检出其核酸片段，故对于这些患者，NGS检测的诊断意义有限，抗体检测可能是其更为有效的临床诊断方法
对于部分颅内脓肿或肉芽肿患者，由于其病灶局限于脑实质，释放到脑脊液中的病原体含量有限，因此对于这些疾病，只有对组织标本进行NGS检测才可能测得病原体。
2.特异度较低：
特异度较差是制约NGS临床应用的另一个主要问题，在NGS报告中经常可以看到不致病病原体、不相关病原体、不明确病原体。
在非神经感染性疾病如阿尔茨海默病或肌萎缩侧索硬化患者的脑脊液和脑实质内，可检测到真菌、细菌或病毒的核酸片段和特异蛋白成分，提示病原微生物是神经变性病潜在的触发因素可能，但其临床意义目前尚未完全明确，而其是否能成为最终的治疗靶点还有待探索
五、处理策略
1. 建立责任病原列表：对已报道的可致人类中枢神经系统感染的细菌、真菌、病毒等微生物建立列表，一旦在NGS检测中出现该致病病原体的片段，即认定为是致病病原体
2. 建立脑脊液常见微生物数据库
3. 脑脊液微生物菌群的意义，探索神经变性病和神经感染的关系提供线索和依据。
诊断学理论与实践 2018年7月第17卷第4期
作者：冯国栋 贺旻 汪昕（复旦大学附属中山医院神经内科）
首发 | 第67病区
作者 | Ryan Lau/刘锐
编辑 | Ryan Lau/刘锐
插图来源 | 网络
题图来源 | 网络