科研│CELL : 单细胞分析确定表达CD19的脑壁细胞是CAR-T免疫治疗的潜在非肿瘤靶点
编译：微科盟 逍遥君，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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靶向CD19的免疫治疗在临床上对B细胞恶性肿瘤的治疗是有效的，但也会引起高发生率的神经毒性。一组接受嵌合抗原受体(CAR) T细胞或双特异性T细胞参与(BiTE)抗体治疗的患者表现出严重的神经毒性，包括与T细胞浸润相关的致死性脑水肿。本研究发现内皮周围的脑壁细胞表达CD19，这对血脑屏障的完整性至关重要。研究人员使用单细胞RNA测序数据鉴定了CD19在脑壁细胞中的表达，并在蛋白水平上确认了血管周围染色。大脑中CD19的表达开始于发育早期，伴随着壁细胞谱系的出现，并贯穿整个成年期的大脑区域。小鼠壁细胞CD19表达水平较低，表明临床前神经毒性动物模型存在局限性。这些数据表明，CD19靶向治疗中存在靶向神经毒性机制，并强调了人类单细胞图谱在设计免疫疗法中的实用性。
论文ID
原名：Single-Cell Analyses Identify Brain Mural Cells Expressing CD19 as Potential Off-Tumor Targets for CAR-T Immunotherapies
译名：单细胞分析确定表达CD19的脑壁细胞是CAR-T免疫治疗的潜在非肿瘤靶点
期刊：Cell
IF：38.637
发表时间：2020年10月
通讯作者：Ansuman T. Satpathy
通讯作者单位：美国斯坦福大学
DOI号：10.1016/j.cell.2020.08.022
实验设计
结果
1 通过scRNA-seq分析在人脑中鉴定CD19+脑壁细胞
通过分析来自2364个人类前额皮层细胞的scRNA-seq数据（图1A）。对细胞聚类后，主要分析了非神经元，非红系细胞。按照特异性表达标志基因将这些细胞进一步分为星形胶质细胞，淋巴细胞，小胶质细胞，少突胶质细胞前体，内皮细胞和脑壁细胞群（图1B-D）。但有少量细胞，表达CD19的同时共表达了CD248（图1E）。此外，淋巴细胞标记基因和脑壁细胞标记基因的表达是完全相反的，CD19仅在脑壁细胞内特异性表达（图1F）。为了查看CD19在脑壁细胞中表达的水平，将CD19的表达与已知的脑壁细胞标记基因进行了比较，结果发现CD19在基因表达的第86个百分位数中高表达（图1G）。
为了验证CD19是否可以作为脑壁细胞标记基因，在其他来自人前额皮层细胞和人腹侧前脑的scRNA-seq数据集进行分析，结果发现可检测到CD19（图2A、2B）。并且CD19在基因表达的第86和第71个百分位中排名较高，表明其表达相对较强（图2C）。
2 IHC在成人大脑中的CD19表达
为了评估CD19蛋白在人脑壁细胞中的表达，使用人CD19抗体对健康死者脑部样本进行了几个区域的免疫组织化学。结果发现在血管周围区域邻近血管基底膜壁的细胞上存在CD19表达（图3）。在多个大脑区域，尤其是海马、岛突、颞叶、额叶和顶叶等特定区域观察到较高的CD19阳性细胞率。相反，在脑桥和枕叶之类的区域显示出较低的CD19阳性细胞率（图3）。此外，沿着较小的毛细血管和较大的血管也发现了CD19阳性细胞，这表明，除了脑壁细胞外，CD19还可在血管平滑肌细胞中表达。
图3. 人脑中CD19的代表性免疫组织化学染色。
3 周膜细胞和血管平滑肌细胞的分析显示跨壁细胞的CD19表达
基于前面的IHC染色，表明CD19+可能是脑壁细胞的普遍特征，因此用网络上能够获取的数据组成了一个大型scRNA-seq数据集，以此来分析脑壁细胞和血管平滑肌细胞的转录特性。对数据进行除杂，然后对细胞进行分群（图4A）。将同一群细胞汇总在一起，称之为“元细胞”，其代表该群细胞的平均基因表达。使用这种方式确定了885个元细胞，在885个元细胞中鉴定出高度可变的基因，然后使用这些基因进行降维和聚类（图4B）。分析表明，CD19在神经血管元细胞群中高度表达（图4C和4D）。元细胞分析没有显示出脑壁细胞和内皮细胞之间的明确分离（图4E和4F）。此外，脑壁细胞标记基因的表达与CD19的表达密切相关（图4G）。在小胶质细胞簇中也观察到了低水平的CD19表达（图4G和4H）。
结果表明，根据CD19可以在这些数据中清楚地区分未分化的祖细胞和分化的脑壁细胞，因为一旦脑壁细胞出现，它们就会表达CD19（图4E，4F），而且用CD19也可以显著区分表达神经血管标记的元细胞与所有其他元细胞（图4I），这有利于细胞鉴定。
图4. 元细胞聚类鉴定人神经血管元细胞中的CD19表达。（A）样品处理方式示意图；（B）元细胞的UMAP投影，按样本年龄或群集进行着色；（C）CD19和（D）PAX3的表达；（E）所有样品中脑壁细胞标志物平均表达的直方图；（F）与（E）中相同的直方图，但按样品年龄分开；（G）散点图显示壁细胞标志物基因与CD19表达的相关性；（H）元细胞的UMAP投影，由小胶质细胞标志物的平均表达着色；（I）基因表达热图。
重新分析非神经元子集（壁细胞，内皮细胞和小胶质细胞）并聚类（图5A和5B），观察到这些细胞表现出脑壁细胞标记物（例如ABCC9和KCNJ8）的大量富集，而没有ACTA2或其他血管平滑肌细胞标记物基因的富集，表明它们代表了真正的脑壁细胞（图5C）。
使用来自BICCN数据集的细胞重复了此分析，对神经血管细胞和相关祖细胞进行了详细分析。研究鉴定出了92K个单细胞，分别代表NVU和早期祖细胞（图4B）。从早期的时间点注意到祖细胞的分叉似乎是神经谱系偏向的，而其他的似乎偏向非神经元谱系。然后将非神经元偏置的祖细胞以及脑壁细胞和内皮细胞簇作为子集进行进一步分析。这些26K细胞在CS12–CS15的祖细胞和GW20–GW25的分化的NVU细胞之间有清晰的分离（图5D和5E）。它们代表了来自许多大脑区域的细胞（图5F）。值得注意的是，由于壁细胞比血管平滑肌细胞更为丰富，研究人员在此数据集中发现了较小的血管平滑肌细胞群体，这可能是由于BICCN数据中的细胞数量很高（图5G）。这些细胞显示出ACTA2和TAGLN的高表达，以及其他脑壁细胞标记（如RGS5）的良好表达（图5H）。重要的是，CD19也在血管平滑肌细胞群体中表达，这与这两个群体之间的高转录相似性相一致。这表明CD19表达不是脑壁细胞独有的，而是人脑壁细胞中的共同特征，与IHC观察到的染色模式一致（图3）。注意到，将血管平滑肌细胞群体的身份进一步分配给小静脉，动脉和小动脉亚群是具有挑战性的，因为在小鼠中鉴定出的规范标记与该人类数据集中鉴定出的亚群并不完全吻合，提示小鼠和人类脑壁细胞之间存在转录差异。
在BICCN数据集中，观察到壁细胞簇中内皮标记基因的表达较高，反之亦然。例如，尽管内皮细胞和壁细胞簇是可区分的，但CLDN5和内皮细胞标记物以及CSPG4的表达比预期的重叠得多（图5G）。推测这很可能是由于组织解离过程中这两种细胞类型的不完全分离，因为紧密相互作用的NVU中的细胞难以完全解离，并且交叉污染很普遍。但是，对先前数据集的分析以及对单个BICCN数据集的分析显示，神经血管细胞的分离程度更高，并且清楚地表明CD19表达主要在脑壁细胞而不是内皮细胞中发生（图1F，5B）。
图5. CD19在脑壁细胞和血管平滑肌细胞中均表达。（A）来自Zhong、La Manno等人的非神经元细胞亚群。（B）用于聚类的标记基因的表达。显示了每个基因的最大TPM（y轴）。（C）（左）血管平滑肌细胞标记基因的低表达和（右）脑壁细胞标记基因的高表达。（D–F）BICCN数据的神经血管和祖细胞子集。（G）血管平滑肌细胞标记（ACTA2）以及CSPG4（脑壁细胞）和CLDN5（内皮）标记的表达。CD19主要在血管平滑肌细胞和壁细胞簇中表达。（H）轨迹图显示缺乏早期发育标志物表达以及血管平滑肌细胞和脑壁细胞簇之间的区别标志物。
4 在成年人的大脑中表达了CAR-T细胞识别的CD19亚型
接下来，分析成人大脑中CD19的表达，以补充先前通过免疫组织化学观察到的结果。相对于神经元或神经胶质种群，由于组织获取困难且大脑中神经血管细胞数量少，因此对成年人类大脑样本中的壁细胞进行scRNA-seq分析具有挑战性。此外，大多数现有的数据集都针对感兴趣的神经元群体进行了前瞻性丰富。因此，要询问成人样本中是否还存在脑壁细胞中的CD19表达，利用了艾伦研究所Brainspan项目生成的跨人类年龄和大脑区域的大量RNA-seq数据。这些数据包含来自不同大脑区域的500多个产前和产后样本。由于在不同样本中分析的大块组织将具有不同比例的脑壁/血管细胞，因此整个样本中脑壁基因的相对表达可替代大块组织中脑壁细胞的潜在比例。
首先确认CD19在产前和产后样品中均以相似的水平表达，并且也在不同大脑区域的样品中表达（图6A）。接下来，仅对产后样品进行了全基因组关联分析，以鉴定与CD19共表达的基因。令人惊讶的是，该分析表明，在这些数据中，CD248，CSPG4，ANPEP，FOXS1和FN1位于与CD19相关的基因的前1％（图6B和6C）。此外，与CD19最相关的前200个基因与NVU相关的基因富集分析中也有丰富的表达，例如血管生成，血管生成，对体剪切应力的反应以及多个细胞外基质相关术语（图6D）。这表明成年大脑中CD19的表达主要是脑壁细胞丰富而不是B细胞丰富的结果。然后，将来自人脑和外周血单核细胞（PBMC）的scRNA-seq数据整合到成人大脑中的CD19相关基因模块中（STAR方法）。除其他脑细胞和PBMC之外，这还允许比较脑壁细胞，内皮细胞和B细胞中的基因模块评分。作为对照，与CD22和CD74相关的基因模块是两个高度表达的B细胞富集基因，在B细胞中富集，而CSPG4基因模块在壁细胞中高度富集（图6E，）。相反，CD19相关基因模块的表达在脑壁细胞中最高（图6E）。注意到CD19的表达似乎随着年龄的增长而降低（图6A）。这可以用两种可能的机制来解释：（1）CD19 +细胞的比例随时间变化，或（2）脑壁细胞中CD19表达水平随时间变化。最后，探究在成年大脑中表达的CD19亚型是否包含临床CAR-T细胞和BiTE识别的特定CD19表位。对成年人类大脑中每个CD19外显子的平均表达的分析表明，各外显子之间的表达均匀分布，这清楚了关键外显子2和4的表达（图6F）。
5 CD19 CAR-T细胞治疗小鼠模型的神经毒性分析
接下来，询问在小鼠中人脑壁细胞中CD19的表达是否保守，这将允许使用小鼠模型来研究人神经毒性的机制。首先，按照先前描述的方案从健康的C57BL / 6J小鼠中提取并分离了全脑，并通过流式细胞仪分析了CD19的存在。这揭示了CD45高CD19+ B细胞群体的存在，正如预期的那样，还揭示了CD45-CD19 +细胞的罕见群体，其表达CD19的水平与B细胞相似，但不表达B细胞标记物B220。与人类数据中观察到的相反，被鉴定为CD13+CD45的脑壁细胞确实对CD19呈阳性，尽管很少见。为了在转录水平上检查这一点，对分离的整个小鼠脑中分离的细胞进行了scRNA-seq测序，然后富集CD19+，CD13+和CD31+细胞。这项分析再次证实，与人脑壁细胞的scRNA-seq相比，脑壁细胞中CD19的表达相对于CD19+ B细胞低，并且细胞较少。总之，这些数据表明，与人脑相比，小鼠脑中CD19 +脑壁细胞相对较少。
鉴于小鼠中存在非B CD19 +细胞，询问是否将CD19定向的CAR-T细胞输注到免疫缺陷，无肿瘤的NSG小鼠中是否会导致可观察到的神经系统疾病表型。由于NSG小鼠不发育B细胞，因此在该模型中观察到的任何表型都是B细胞独立的，不能归因于B细胞靶向后与CRS相关的整体效应。生成了基于CD28或基于4-1BB的CAR-T细胞，它们在信号传导域上有所不同，但都在临床上使用，靶向人或小鼠CD19。
输注CAR-T细胞7天后，NSG小鼠接受了靶向鼠CD19的CAR-T细胞，但那些接受了靶向人CD19的CAR-T细胞的小鼠却没有表现出BBB通透性的提高。EBD与白蛋白结合，白蛋白通常在生理条件下保留在血液中；当血脑屏障被破坏时，白蛋白能够进入脑实质。第四组未接受输血的小鼠未显示EBD染色，第五组在接受EBD时接受了甘露醇的代表阳性对照的小鼠表现出较高的EBD染色，如图所示。与mCD19BBz CAR-T细胞组相比，mCD1928z的作用更高，这可能是CD28域提供的更强抗原受体信号传导的结果（Salter等人，2018）。确实，先前的研究表明，共刺激结构域的选择强烈影响基于CD28的CAR对抗原密度的敏感性，特别是对低水平的抗原密度敏感。使用同基因的，具有免疫能力的C57B1 / 7J模型重复该实验，并用环磷酰胺作为淋巴结消减预处理方案进行预处理。同源研究总结了在NSG模型中观察到的BBB通透性模式，表明同源模型中鼠CD19+B细胞的存在并不影响仅在靶向鼠的条件下观察到的BBB特异性破坏（图6E）。最后，从接受治疗的小鼠中分离了大脑，并进行了流式细胞术以测量CAR输注后CD19+脑壁细胞的消耗。接受mCD1928z而非hCD1928z的小鼠显示CD45+CD19+B细胞以及CD45–CD13+CD19+脑壁细胞均减少。
总之，这些实验表明，尽管与人脑壁细胞相比，小鼠脑壁细胞中CD19表达的频率较低，但对CD19定向的CAR-T细胞的施用仍可在缺乏B细胞的小鼠中引起BBB渗漏和脑壁细胞耗竭。可能通过靶向小胶质细胞或尚未鉴定的其他表达CD19的细胞类型来介导某些这种作用。这些实验表明，尽管可以在临床前小鼠模型中测量CAR-T功能和毒性的某些方面，但存在重要的局限性，因为细胞类型和转录状态的物种特异性差异可能无法完美匹配人类特异性病理生理。实际上，最初在小鼠模型中进行的CAR-T细胞研究并未预测后来在人类临床试验中观察到的神经毒性程度。
6 脑特异性表达CD19
由于壁细胞存在于多个器官中，对来自肺的壁细胞和血管平滑肌细胞进行了脑壁细胞的比较分析，肺是高度血管化的组织，壁细胞和内皮细胞数量很高。尽管所有壁细胞群都显示出核心转录同一性的共享表达，例如PDGFRB，RGS5，FOXS1和KCNJ8，但发现了大脑和肺壁细胞之间的许多转录差异（图7A）。值得注意的是，CD19在脑壁而非肺壁细胞中特异性表达。两种细胞类型在谱系特异性转录因子上的广泛差异可以解释这种器官特异性。
最后，探究是否相对于肺壁细胞和B细胞而言，预测位于膜或细胞表面的基因是否在NVU中差异表达，并且可用于提高CD19定向CAR-T的安全性（图7B和7C）。在脑与肺壁细胞以及B细胞与脑壁细胞和内皮细胞中鉴定出被注释为分泌或位于细胞表面的那些中最高的差异表达。这些可以通过要求两种抗原的双重识别来提高针对B细胞的CAR-T细胞的特异性。这项分析揭示了额外的基因，例如CD74，HLA-DRA和LTP，它们相对于脑壁细胞在B细胞上都高度表达并高度富集（图7C）。提高CAR-T细胞特异性的另一种方法是使用“ NOT”门，其中抑制性CAR构建体识别非特异性靶蛋白并阻止T细胞活化。
结论
本研究描述了CD19 CAR-T细胞介导的神经毒性的可能的靶标机制，这可能是由于CD19在人脑壁细胞中先前未被识别的表达所引起。研究显示CD19表达存在于多个独立的数据集中，并存在于壁细胞和血管平滑肌细胞中。这一发现将为将来在人类样本中的研究提供参考，包括对患有神经毒性的患者的研究。这项研究将着重开发用于临床医学的综合人类单细胞图谱的众多实用工具之一。
1 科研│PNAS：高分辨率小鼠脑室下区干细胞微环境转录组揭示了谱系、解剖和衰老的特征
不来关注一波嘛
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