科研 | SCI TOTAL ENVIRON：酪丁酸梭菌过表达吸氢酶基因的转录组分析（国人佳作）
编译：寒江雪，编辑：景行、江舜尧。
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酪丁酸梭菌(Clostridium Tyrobuyricum)是一种有前途的生产生物燃料的微生物。本研究发现酪丁酸梭菌中过表达吸氢酶基因hyd2293，对氧化还原反应和代谢过程产生显著影响。与野生型菌株(Ct-Wt)相比，突变菌株Ct-hyd2293的丁酸产量降低了约34%，醋酸盐产量增加了约148%，氢气产量降低了约11%，并产生丁醇。转录组分析结果发现，hyd2293过表达后有666个基因差异表达，其中82个基因表达上调，584个基因表达下调。上调基因主要参与碳水化合物和能量代谢，而下调的基因几乎分布在所有途径中。对参与葡萄糖转运、糖酵解、不同发酵途径和氢代谢的基因进行了研究，基因表达的变化揭示了Ct-hyd2293代谢通量重新分配的机制。吸氢酶的过表达将电子从氢和丁酸重新定向到丁醇。此外，参与节约能量和产孢的关键酶基因的转录水平普遍降低。本研究证实了酪丁酸梭菌过表达吸氢酶后的转录反应，为更好地理解酪丁酸梭菌代谢特性提供了依据，并证明了氧化还原过程在生物燃料生产代谢工程中的潜在作用。
论文ID
原名：Comparative transcriptome analysis of Clostridium tyrobutyricum expressing a heterologous uptake hydrogenase
译名：酪丁酸梭菌异源表达吸氢酶基因的转录组分析
期刊：Science of the Total Environment
IF：6.551
发表时间：2020年8月
通讯作者：任南琪
通讯作者单位：哈尔滨工业大学环境学院
DOI号：10.1016/j.scitotenv.2020.142022
实验设计
结果
从E. harbinense基因组中克隆氢酶基因hyd2293，插入载体pMTL82151天然硫解酶启动子后。将重组质粒pHYD2293通过接合方式转化 C. tyrobutyricum，并对突变菌株进行菌落PCR，质粒内切酶酶切和测序鉴定。
2 葡萄糖分批发酵
通过葡萄糖分批发酵，研究hyd2293对 C. tyrobutyricum代谢特性的影响（图1）。突变株和野生株的葡萄糖消耗速率相似，~50g/L的葡萄糖在~50h内全部消耗。Ct-hyd2293的生长速率为0.20h−1，与对照组(0.22h−1)相比，具有统计学差异(P<0.01)（表1）。Ct-hyd2293的最大细胞OD600显著降低到8.76，比野生型降低了35.55%，说明过表达导致了细胞的代谢负荷。突变株产氢减少11.24%，Ct-hyd2293菌株的H2/CO2比值为1.25，低于野生菌株的H2/CO2比值(1.38)。突变株的丁酸产量比野生株低34.04%，而乙酸产量提高了148.10%。突变株的乙醇产量也提高了56.25%，Ct-hyd2293产生2.50g/L丁醇，而野生型菌株不产生丁醇。在Ct-hyd2293中，C4/C2摩尔比为2.06，远低于Ct-WT中的C4/C2摩尔比。尽管代谢模式发生了显著变化，但Ct-hyd2293的总液体产物与Ct-WT相当。碳平衡分析表明，Ct-hyd2293具有较高的生物量。Ct-hyd2293发酵过程中菌体密度低可能与诱变细胞死亡和自溶有关。携带表达氢酶的重组质粒的突变体有额外的代谢负担，细胞内还原能力增加，这可能导致增加了细胞死亡和自溶。丁醇的毒性也可能增加细胞自溶，导致OD600急剧下降。
发酵结果表明，hyd2293在 C. tyrobutyricum的代谢过程中扮演着神秘的角色。氢酶是一种催化质子还原可逆反应的金属酶，过表达通常会增加产氢量。hyd2293的引入可以氧化分子氢，提高NAD(P)H水平。为保持胞内NAD(P)H：NAD(P)+的平衡， C. tyrobutyricum产生还原程度更高的产物丁醇，每摩尔丁醇消耗4mol NAD(P)H。这一过程与之前的研究，敲除或下调氢酶可促进丁醇的合成相似。然而，hyd2293基因表达所触发的丁醇产生途径尚不清楚。推测hyd2293的表达增加了 C. tyrobutyricum的还原能力，从而激活了内源丁醇产生途径，编码催化这一途径蛋白质的基因还有待进一步研究。
丁醇产量的增加节流了流向丁酸的碳通量，从而使丁酸的产量显著降低。由于丁酸是通过 C. tyrobutyricum中乙酸盐的再同化产生的，所以丁酸的减少导致了乙酸盐滴度的显著增加。在 C. tyrobutyricum中，丙酮酸代谢中产生ATP的主要反应是乙酸盐和丁酸的生成。在突变菌株中，乙酸盐产量的增加也是对丁酸生成途径中ATP产量下降的反应，以恢复细胞生长和其他过程中的ATP水平。在葡萄糖发酵过程中，转化为乙酸酯可生成4mol ATP，而丁酸盐可生成3mol ATP。因此，乙酸盐含量的增加不仅是乙酸盐再同化作用降低的结果，也是丁酸生产中ATP生成量减少的一种ATP补偿策略。
图1.葡萄糖发酵图谱。
表1.酪丁酸菌菌株发酵特性的比较。
3 酶活性分析
以野生型菌株为对照，通过测定氢酶活性以验证hyd2293的表达。突变株Ct-hyd2293的氢酶活性比野生株高60.91%(图2)，说明外源氢酶在 C. tyrobutyricum中成功表达。为了验证Ct-hyd2293中丁醇的产生，测定了丁醇相关酶，包括丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶的活性。Ct-hyd2293的丁醛脱氢酶活性是野生菌株的3.3倍，丁醇脱氢酶活性是野生菌株的1.5倍。与表达醛/醇脱氢酶(Ct-pMAD72)的 C. tyrobutyricum相比，Ct-hyd2293的丁醛脱氢酶活性与其一致，丁醇脱氢酶较低。丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶活性的显着提高为突变株醇产量的增加提供了有力的证据。
图2.氢酶、乙醛脱氢酶、丁醇脱氢酶活力测定。
4 C. tyrobutyricum对hyd2293过表达的转录反应
本研究共鉴定出3047个基因，占 C. tyrobutyricum基因组基因总数的97.7%。在葡萄糖发酵中，hyd2293过表达后有666个基因显著差异表达，其中82个基因表达上调，584个基因表达下调（图3）。
对差异表达基因（DEG）进行GO注释分析，涉及分子功能、细胞成分和生物过程三个功能类别（图4）。在分子功能中，注释到基因数最多的两个功能是催化活性和结合。在细胞成分中，DEG主要富集在细胞、细胞部、膜和膜部分。在分子功能中细胞过程和代谢过程这两个功能注视到基因数最多。根据转录本的变化，找出在各种代谢途径中起作用的活性基因，这将有助于加深对 C. tyrobutyricum代谢特性的了解。
图3.葡萄糖发酵过程中Ct-hyd2293基因表达分布的火山图。
图4. Ct-hyd2293中DEG的GO功能富集分析。
4.1 糖运输和糖酵解基因的表达
图5显示了Ct-hyd2293在葡萄糖发酵过程中基因表达变化的概况。与其他细菌一样， C. tyrobutyricum主要利用磷酸转移酶系统(PTS)进行葡萄糖摄取和磷酸化。与Ct-WT相比，Ct-hyd2293中I酶的表达显著降低，而HPr蛋白的转录水平保持不变。编码葡萄糖PTS酶IIA亚基的CTK_RS13550，在突变株和野生型菌株中其转录水平都很低。突变株中CTK_RS09910的转录水平与野生株相似。编码糖转运蛋白家族MFS转运蛋白的3个基因(CTK_RS02165、CTK_RS03685和CTK_RS10135)的表达水平均较低，而在Ct-hyd2293和Ct-WT中的表达差异不显著，表明PTS是葡萄糖吸收的主要途径。
糖酵解是C. tyrobutyricum将葡萄糖转化为丙酮酸的主要途径。导入hyd2293之后，几个糖酵解酶表达下调，其余的酶表达水平不变。6-磷酸果糖激酶(PFK，CTKRS13420)的TPM从172.0降至22.0，因为它参与了一个限速步骤，可能减缓了糖酵解过程。磷酸甘油酸激酶(CTK_RS01235)和磷酸甘油酸变位酶(CTK_RS01245)的表达也降低，从而限制了甘油-1，3-PP向甘油-2-P的转化。除这三种酶外，其余大多数糖酵解酶在野生型菌株中都高表达。尽管pfk的低表达可以缓解糖酵解，但是Ct-hyd2293的葡萄糖消耗速率与Ct-WT相当，表明这些下调的基因对葡萄糖利用的影响是有限的。由于PFK活性受到多种因素的影响比如ATP水平等，因此推测突变体中的PFK活性没有受到显著影响。
4.2 发酵途径中的基因表达
碳通量流向丙酮酸新陈代谢中的一系列末端代谢物，包括酸、溶剂和气体。在 C. tyrobutyricum中，丙酮酸可以被乳酸脱氢酶(LDH)转化为乳酸。从转录丰度来看，产L-乳酸的LDH(CTK_RS03605和CTK_RS05715)比产D-乳酸的LDH(CTK_RS06845)表达更活跃，表明L-乳酸优先。在本研究中，Ct-hyd2293和Ct-WT的发酵液中均未检测到乳酸盐。
丙酮酸：铁氧还蛋白(黄还蛋白)氧化还原酶(PFOR)是 C. tyrobutyricum中催化丙酮酸脱羧为乙酰辅酶A的关键酶。CTK_RS10420和CTK_RS12320都编码pfor，但后者表达较低，而前者是组成性表达的，表明CTK_RS10420是 C. tyrobutyricum的主要pfor基因。CTK_RS10420在CT-hyd2293和CT-WT中的表达差异无统计学意义。丙酮酸的另一条脱羧途径是由丙酮酸甲酸盐裂解酶(PFL)(CTK_RS10685和CTK_RS02540)催化生成甲酸盐。与Ct-Wt相比，Ct-hyd2293中CTKRS10685的表达下调5.5倍，而CTKRS02540的表达上调4.3倍，表明突变株中的CTKRS10685在丙酮酸脱羧反应中表现出更高的活性。
丙酮酸脱羧后分解为乙酰辅酶A和二氧化碳(或甲酸盐)。乙酰辅酶A是生产乙醇、醋酸酯、丁酸酯和丁醇的关键中间体。丁酸是野生 C. tyrobutyricum的主要液体产物，其选择性为0.91g/g-总液体产物，但在Ct-hyd2293中其产量显著降低。乙酰乙酰辅酶A向乙酰辅酶A的转化是C4产物合成的第一个关键反应，相应的乙酰辅酶A C-乙酰基转移酶(THL，CTK_RS00800)在Ct-hyd2293中保持着相似的表达水平（图5）。催化3-羟基丁酰辅酶A转化为巴豆酰辅酶A的巴豆酶(CRT，CTK_RS12810)被下调20多倍。在巴豆酰-辅酶A与丁酰辅酶A的反应中，主要的丁酰辅酶A脱氢酶(BCD，CTK_RS12720)没有变化，而另一种BCD(CTK_RS12805)的表达下调了20倍以上。CoA转移酶(CoAT，CTK_RS03145)是催化丁酰辅酶A和乙酸酯再合成丁酸的关键酶，其转录也被下调了13.3倍。丁酸生产途径中关键酶的急剧下调解释了丁酸产量大幅下降(~34.02%)和C4/C2比值降低的原因。在表达adhE2的 C. tyrobutyricum中，丁醇产量增加，丁酸产量降低，而硫解酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶和巴豆酶的表达水平都显著增加。
在已注释的 C. tyrobutyricum基因组中均未发现酪丁酸丁醛脱氢酶(bld)和丁醇脱氢酶(bdh)这两个催化丁基辅酶A生成丁醇的基因。但是，在突变体中发现丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶的活性增加。本研究和之前的研究都发现野生株的bld和bdh较弱的酶活性，说明内源基因在bld和bdh中的重要的作用。通过KEGG功能注释分析及之前的蛋白质组学分析发现，Ct-hyd2293中可能有两个含铁的乙醇脱氢酶（ald，CTK_RS09175和CTK_RS04490）负责生产丁醇，但与Ct-WT相比，这两个ALD的转录本表达并不高。表明在Ct-hyd2293中可能存在其他功能基因，如bld和bdh，通过这些基因的上调以催化丁醇的形成，以平衡氢氧化增加的还原力。今后还需要进一步研究该突变体中丁醇发生的相关基因。
突变株中的乙醇产量也增加了，但乙醇效价仍然很低。CTK_RS09175和CTK_RS06025是介导 C. tyrobutyricum中产生乙醇的ald，前者表达量较高，起主要作用，后者表达量较低。
乙酰辅酶A在磷酸转乙酰酶(PTA)和醋酸激酶(Ack)的催化下合成乙酸酯，其中ack基因(CTK_RS08750)的表达显著下调，而PTA基因(CTK_RS08755)的表达水平保持不变。调节醋酸酯合成的ack基因下调了6.3倍，而介导醋酸酯再同化的基因下调了13.3倍，从而提高了醋酸酯的净产量。
图5. Ct-hyd2293细胞中枢代谢途径基因表达的变化。
4.3 产氢相关基因的表达
hyd2293是一种吸氢酶，这可能是Ct-hyd2293产氢量低于野生菌株的原因。产氢是处理细胞中多余的还原能量的途径，还原能量代谢的主要反应如图5所示。过表达吸氢酶，过量的还原功率需要处理才能保持平衡，从而触发了丁醇生产消耗4 NAD(P)H/丁醇，而丁酸生产消耗2 NAD(P)H/丁酸。
在Ct-hyd2293中，除了还原能力的变化外，催化氢气合成的天然氢酶的表达也发生了变化（表2）。CTK_RS02545、CTK_RS12765和CTK_RS14455的表达丰度较高，推测它们编码 C. tyrobutyricum的主要氢酶或相关亚基。与CT-WT相比，突变菌株中CTK_RS12765和CTK_RS14455在CT-hyd2293细胞中的表达无明显变化。CTK_RS02545在突变体中高表达，其转录量是野生株的2.3倍。过表达吸氢酶增加了细胞内NADH的水平，改变了NADH/NAD+的比值，从而限制了铁氧还蛋白-NAD+还原酶将还原的铁还蛋白转化为NADH。CTK_RS02545在Cthyd2293中高表达，增加的铁还蛋白向铁氧还蛋白非依赖性氢酶提供电子，以处理过量的还原能力。然而，净产氢量的下降表明，该途径中增加的产氢量不能hydF(CTK_RS14615)的表达均显著降低。hydE和hydF基因的下调将对Ct-hyd2293细胞氢酶的成熟和活性产生负面影响。
表2. Ct-hyd2293细胞氢酶基因的差异表达。
4.4 节能相关基因的表达
C. tyrobutyricum具有3种能量守恒机制，包括核因子复合体(CTK_RS06275-300)、NfnAB(CTK_RS12780和12785)和丙酮酸磷酸二激酶(CTK_RS11565)。在Ct-hyd2293中，NfnAB和丙酮酸-磷酸二激酶的转录水平与Ct-WT中相同，表明能量守恒过程的保守性。RNF复合体和ATP合成酶形成了另一条结合质子梯度的ATP发生途径。在CT-hyd2293中，编码RNF复合体和ATPase的基因普遍下调。RNF亚基C、D、G(CTK_RS06275-85)和B(CTK_RS06300)表达显著下调。 C. tyrobutyricumF1FoATP合成酶是催化 C. tyrobutyricum从跨膜质子梯度合成ATP的主要酶，是一种多亚单位的酶复合体。 C. tyrobutyricum的F1FoATP合成酶只有8个亚基，在Ct-hyd2293中，atpe(C)、atpF(B)、atp(δ)、atpa(α)和atpG(γ)的表达水平显著降低，而其他3个亚基基因的表达水平没有明显变化，这可能降低了突变株从质子梯度产生ATP的能力。
4.5 孢子形成
除代谢过程外，突变株的细胞过程如产孢等也受到影响。 C. tyrobutyricum表达芽胞形成特异性转录基因和4个Sigma因子(SigH、SigE、Sigf、SigG和SigK)来完成孢子形成过程。基于梭状芽胞杆菌产孢信号级联模型的研究，图6显示了Ct-hyd2293产孢相关基因的表达变化。Spo0A(CTK_RS09345)是产孢子的主要转录hyd2293中的表达显著降低了6.9倍。酪丁酸杆菌的乙醇和丁醇的产生是与生长相关的，而不是像溶剂型梭状芽胞杆菌通常观察到的那样是由产孢子诱导的。因此，Spo0A的表达水平不影Spo0A的下调是一致的。SigH基因的抑制子AbrB蛋白(CTK_RS00405)的表达水平显著增加，导致SigH的抑制作用更强。两个HKs(CTK_RS01270和CTK_RS02140)在 C. tyrobutyricum中进行Spo0A的磷酸化，并且这两个基因表达水平相似。SigK(CTK_RS09035)在Ct-WT和Ct-hyd2293中的表达均很低(TPM<2.4)，说明SigK可能在孢子形成后期表达较活跃。
在Spo0A磷酸化启动产孢过程中，Sigf、SiGe、Sigg和SigK依次激活，进而形成孢子（图6）。RNA测序是在孢子形成早期的细胞中进行的，而在孢子形成的后期，基因的表达相对较弱。与Ct-Wt相比，Ct-hyd2293在产孢级联中的关键基因的表达普遍下调。参与孢子皮层形成的SigF(CTK_RS04305)和SigG(CTK_RS09000)均显著减少。同时，控制SigF活性的spoIIAA (CTK_RS04295)和spoIIAB (CTK_RS04300)也被下调。在母细胞中，关键调控因子SigE(CTK_RS09005)表达下降了约186倍。sporeIIGA (CTK_RS09010)和sigK(CTK_RS09035)的表达没有变化，但转录水平很低。因此，hyd2293的表达显著削弱了 C. tyrobutyricum的产孢能力。
图6. Ct-hyd2293产孢过程中基因表达的变化。
结论
本研究通过过表达一种吸氢酶来研究其对 C. tyrobutyricum还原能力平衡和代谢网络分布的影响。过表达增强了氢氧化作用，从而改变了发酵过程，触发了丁醇的生产。转录组分析过表达hyd2293后的表达变化，确定了编码中心代谢途径主要酶的基因，并对其表达变化进行了研究，以解释发酵过程中的变化。负责丁醇生产的bld和bdh基因仍有待鉴定。主要的能量守恒机制没有改变，而RNF复合体和ATP合成酶的表达下调。本研究对 C. tyrobutyricum的代谢有了更深入的认识，明确了氧化还原在生物燃料生产代谢工程中的潜在作用。
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