科研 | J CLIN INVEST：转录组学揭示慢性炎症性关节炎的关键调控因子
编译：伊安，编辑：景行、江舜尧。
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目前对于慢性炎症性关节炎的治疗尽管已经取得了明显的进展，但还没有进行全面的分析来系统研究治疗慢性炎症性疾病过程中基因或通路的动态变化。研究人员依据胶原诱导性关节炎(CIA)的进展和消退对小鼠滑膜组织进行动态基因表达谱分析，鉴定出与炎症消退相关的基因。通过网络分析预测出3个治疗CIA模型的分泌型细胞因子：Itgb1、Rps3、Ywhaz。这些因子主要由Treg和M2巨噬细胞表达，它们能够抑制促炎细胞因子的产生。特别是Ywhaz在关节炎消退的小鼠血清和具有良好治疗反应的类风湿关节炎(RA)患者的尿液中升高。此外，腺病毒介导的Ywhaz基因转导到受影响的关节显著抑制CIA小鼠关节炎的进展，并使关节组织、淋巴结和脾脏中促炎细胞因子的表达受到抑制，这表明Ywhaz是治疗RA的重要靶点。因此，研究人员通过转录组学对慢性炎症性关节炎过程中的滑膜组织进行综合分析，发现了可以作为预测疾病消退的分子标志物：Itgb1、Rps3、Ywhaz，这三个生物标志物同时也可以作为慢性炎症性关节炎的治疗靶点。
论文ID
原名：Dynamic transcriptome analysis unveils key proresolving factors of chronic inflammatory arthritis
译名：转录组学揭示慢性炎症性关节炎的关键调控因子
期刊：Journal of Clinical Investigation
IF：11.864
发表时间：2020年8月
通讯作者：Wan-Uk Kim
通讯作者单位：韩国加图立大学
DOI号：10.1172/JCI126866
实验设计
1.建立CIA模型，对不同病理时期关节组织进行基因表达谱分析，并通过qRT-PCR检测不同病理时期促炎、抗炎细胞因子mRNA表达；
2. qRT-PCR、IHC、Western blotting检测滑膜组织中Itgb1、Ywhaz、Rps3 mRNA、蛋白表达；
3. qRT-PCR、流式、Western blotting检测T细胞、巨噬细胞亚群中Itgb1、Ywhaz、Rps3 mRNA、蛋白表达；
4. qRT-PCR检测tgb1、Ywhaz、Rps3对FLSs促炎细胞因子的影响；
5. ELISA分别检测有无抗风湿药干预CIA小鼠血清中Ywhaz水平；
6. qRT-PCR等检测Ywhaz对CIA小鼠的治疗作用。
结果
为了描述CIA模型的炎症反应，研究人员向老鼠尾部注射CFA和CII后进行关节炎评分，来监测随时间变化CIA模型关节炎的临床严重程度。结果与之前研究类似：关节炎在4周时开始诱发， 9周达到高峰，但在15周时自然消退（图1A）。为了验证炎症的消退，在免疫前（非免疫）和免疫后的诱导期（6周）、高峰期（9周）和消退期（15周）对关节组织中促炎细胞因子(Ptgs2、Il6、Il1b)和抗炎细胞因子（Il-4、Il-10、Tgfb1）的mRNA表达水平进行检测（图1B）。研究发现Ptgs2、Il-6、Il-1b mRNA表达水平在高峰期明显高于非免疫期和诱导期。相反，Ptgs2、Il-6的mRNA表达水平在高峰期和消退期之间显著降低，表明炎症受到抑制。同时，Il-4、Il-10、Tgfb1 mRNA表达水平在消退期较非免疫期和诱导期显著上调，表明抗炎反应增强，消退期Il-4、Il-10、Tgfb1的表达水平分别是免疫前的3.7、11.4和7.0倍，也是诱导期的3.0、2.5和2.6倍，而且仍然显著高于高峰期。接下来对诱导、高峰和消退期的CIA小鼠关节组织进行了基因表达谱分析。已知消退期的相关基因参与抑制免疫细胞浸润、吞噬凋亡的免疫细胞和巨噬细胞激活或组织修复（补充 图1A）。此外，用CIBER-SORT方法对在CIA进展过程中的不同免疫细胞活性动态变化进行研究，发现Tregs和M2巨噬细胞在消退期显著增加(P<0.05)，这2种免疫细胞的相关基因表达水平的增加得到证实(补充图1、B和C，以及补充表1和2)。结果表明，与其他免疫细胞相比，Tregs和M2巨噬细胞在CIA进展过程中的活性显著增加(P<0.05)，2个标志免疫细胞抑制的基因上升验证了这一点(补充 图1B、1C，补充 表1、 2)。所有数据支持了研究人员系统分析的有效性。
2 免疫细胞分子机制与CIA治疗相关
为了鉴定和表征与CIA消退相关基因，研究人员接下来对高峰期与诱导期（(P/I)）和诱导期和消退期与高峰期(R/P)的差异表达基因（DEGs）进行了比较分析，发现了P/I 和R/P中各有1795和1881个差异表达基因（补充 表3）。然后，选择了6个DEG簇（C1-C6），在消退期显示上调的是C3、 C5，下调的是C2、 C4，同时它们在高峰期上调或下调，并在消退期趋于平稳(图1C和补充 表4)。GO生物学过程（GOBP）富集分析表明，C3和C5分别代表T细胞分化/活化和巨噬细胞(NF-κB信号)功能，C6代表巨噬细胞和白细胞的活化(P<0.05)。(图1D，补充 图2A，补充 表5)。参与T细胞功能的DEG网络模型显示，在CIA进展过程中，TGF-β、JAK/STAT、TCR信号被激活(补充图2B)。qRT-PCR分析证实有4个基因在消退期上调，它们与TGF-β (Smad4)、JAK/STAT (Foxp3)、TCR (Malt1 和 Nfatc3)信号通路相关。这些数据表明，T细胞和巨噬细胞等在内的多种免疫细胞相关信号通路共同促进了CIA模型关节炎的消退。
图1.与CIA消退相关的基因动态变化。（A）CIA模型关节炎评分；（B）qRT-PCR检测免疫前(N)和免疫后I、P、R期的促炎细胞因子(Ptgs2、Il-6、Il-1b)和抗炎细胞因子(Il-4、Il-10、Tgfb1)的水平；（C）消退相关基因簇C1-C6（热图）；(D) C1-C6基因富集的GOBPs；（E）qRT-PCR检测关键调控基因mNRA表达。
3 网络分析治疗CIA的关键调控因子
为了识别CIA消退相关的关键调控因子，研究人员通过蛋白-蛋白相互作用从P/I和R/P比较中构建出包含2836个DEG的网络模型（补充 表6）。然后根据以下标准：(a)在消退期相关网络中发挥关键作用的中心分子（P＜0.05） (b) 与激活T细胞和/或巨噬细胞的功能相关的分泌抗炎因子（补充注释2、图3，补充表7、8)），选择了3个关键调控因子——C3中的整合素β1亚基（Itgb1）、酪氨酸3/色氨酸5单加氧酶激活蛋白ζ（Ywhaz），C5中核糖体蛋白S3 (Rps3)。接下来通过qRT-PCR证实了Itgb1、Rps3、Ywhaz在R/P上调（图 2A）。通过免疫组化（图 2B）和Western blotting（图 2C）检测其蛋白在滑膜组织中的表达，结果表明滑膜组织中3种蛋白的表达水平在消退期明显高于高峰期。Itgb1、Rps3、Ywhaz在CIA大鼠模型中的表达增加(图 2D)，表明它们与CIA消退期相关。
图2. CIA消退的关键调控因子。（A-B）qRT-PCR、免疫组化分别检测关键调控因子Itgb1、Ywhaz、Rps3 mRNA和蛋白的表达；（C）Western blot检测小鼠滑膜组织中Itgb1、Ywhaz、Rps3蛋白表达；（D）Western blotting检测P、R期大鼠滑膜组织中Itgb1、Rps3、Ywhaz蛋白表达。
4 Itgb1、Rps3、Ywhaz在Tregs和M2巨噬细胞中的显著表达
接下来实验是确定消退期哪些免疫细胞Itgb1、Rps3、Ywhaz表达增加，研究人员推测消退期Itgb1、Rps3、Ywhaz表达上调可能是由于表达这些基因的免疫细胞被激活。为了解决这个问题，研究人员对B细胞、巨噬细胞或T细胞激活后3种关键调控因子表达是否上调进行研究。当分别用抗CD3+抗CD28抗体、抗IgM抗体和脂多糖(LPS)处理CD4+和CD8+T细胞、B细胞和巨噬细胞时，流式结果显示Itgb1、Rps3、Ywhaz表达上调(补充图 4A)。与siRNAs处理的CD4+T细胞对照组相比，靶基因siRNAs处理的CD4+T细胞中调控因子的表达显著降低，证实了所用抗体的特异性(补充图4B)。
基因表达分析显示T细胞和巨噬细胞亚群，特别是Treg细胞和M2巨噬细胞与CIA消退密切相关。因此，首先研究了T细胞亚群和这3个关键调控因子的关系。在CD4+T辅助细胞(Th)的多种亚型中，Treg在抑制慢性炎症中起重要作用。因此，研究人员检测了4种CD4+T辅助细胞亚型(Th1、Th2、Th17和Treg；补充 图5)中3种关键调控因子的表达，发现在这4种细胞亚型中均表达(图3 A-C)。然而，通过流式和qRT-PCR检测发现Itgb1、Rps3、Ywhaz在Tregs细胞中表达最高；Th17细胞其次(图 3A-C)。值得注意的是，Ywhaz在tregs细胞中的高度表达，并且其表达高于Th17细胞(图3 A-C)。Western blot分析也证实Itgb1、Rps3、Ywhaz蛋白在Tregs细胞中的表达高于Th1细胞(图3D)。有趣的是，最近研究证明Ywhaz是存在外泌体中最常见的10种蛋白之一，来自肿瘤细胞外泌体的Ywhaz可传递到肿瘤浸润性T细胞，降低它的抗肿瘤活性。为了研究外泌体Ywhaz，研究人员分离出Tregs细胞的外泌体，并证明了Ywhaz蛋白与外泌体标志的CD63共表达，这表明Ywhaz有可能从Tregs向邻近的免疫细胞进行外泌体传递(图3e)。综上所述，这些数据表明这3种关键调控因子可能与Tregs细胞有关，有利于促进CIA炎症消退。
巨噬细胞是参与炎症发展或消退的另一种重要的免疫细胞，根据周围微环境的不同，巨噬细胞可分化为促炎巨噬细胞(M1)或抗炎巨噬细胞(M2)。为了确定Itgb1、Rps3、Ywhaz是否在巨噬细胞中表达，研究人员首先用CD68和每个关键调控因子的双重免疫荧光染色检测了它们在滑膜巨噬细胞中的表达。研究人员观察到CD68和关键调控因子在细胞上共定位表达（图 4），表明CIA关节中的滑膜巨噬细胞表达Itgb1、Rps3、Ywhaz。通过免疫荧光染色，研究人员还比较了滑膜组织中M1和M2型巨噬细胞的分布。在消退期和高峰期滑膜巨噬细胞CD68均有表达，但在消退期(数据未显示)，M2型巨噬细胞标志基因Arg1与滑膜巨噬细胞基因CD68共表达更加频繁 (数据未显示)，这证实M2型巨噬细胞与关节炎消退相关。接下来，研究人员对这3个关键调控因子在M0型巨噬细胞分化的M1和M2中是否存在差异表达进行研究(补充 图6)。qRT-PCR和Western blotting结果显示M2型巨噬细胞Itgb1、Rps3、Ywhaz的mRNA和蛋白表达水平均显著高于M0和M1型巨噬细胞(图4、B和C)。此外，它们在M1型巨噬细胞中的mRNA水平显著(P<0.01)低于M0型巨噬细胞(图4B)，尽管这种差异表达模式在蛋白水平上不那么明显。综上所述，这些数据表明，3种潜在的关键调控因子Rps3和Ywhaz优先表达于抗炎的M2型巨噬细胞，而不是促炎的M1型巨噬细胞，因此M2型巨噬细胞可能参与了CIA的消退。
图3. T细胞中3个关键调控因子Itgb1、Ywhaz、Rps3的表达。（A）检测小鼠CD4 + T辅助细胞未分化和分化亚型中3种调控因子mRNA表达；（B-C）流式细胞术检测CD4+T辅助细胞亚型中Itgb1、Rps3、Ywhaz蛋白的表达；(D) Western blot检测Th1细胞和Tregs中Itgb1、Rps3、Ywhaz蛋白表达；（E）Western blot 检测Treg细胞裂解液和外泌体中Ywhaz、Bcl2、CD63蛋白表达。
图4. 巨噬细胞中3个关键调控因子Itgb1、Ywhaz、Rps3的表达。（A）检测CD68与3个关键调控因子共表达；（B-C）用qRT-PCR和Western blotting分别检测未分化(M0)和分化的M1和M2巨噬细胞中3种关键调控因子mRNA和蛋白的表达。
5 Itgb1、Rps3、Ywhaz调控促炎细胞因子的产生
基于研究之前的发现，Itgb1、Rps3、Ywhaz主要表达于免疫抑制细胞，包括Tregs和M2巨噬细胞，接下来研究通过使用RA相关效应细胞，包括巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞(FLSs)进行体外细胞实验来验证Itgb1、Rps3、Ywhaz的抗炎活性。在LPS刺激的小鼠脾细胞中，重组蛋白Itgb1、Rps3、Ywhaz呈剂量依赖性抑制促炎细胞因子IL-6和或TNF的产生（图 5A）。在腹腔巨噬细胞中，重组蛋白Itgb1、Rps3、Ywhaz也能呈剂量依赖性地抑制LPS诱导的IL-6和TNF mRNA和/或蛋白表达的增加(图5、B和C)。相反，在LPS刺激的腹腔巨噬细胞中，重组蛋白Itgb1、Rps3、Ywhaz则能促进抗炎细胞因子IL-10 mRNA和蛋白表达（图 5D）。研究人员还证实，这些重组蛋白的加入对细胞增殖没有显著影响(补充 图7)。与其对巨噬细胞的作用相比，重组蛋白Ywhaz对抗CD-3抗体+抗CD-28抗体刺激的CD+4 T细胞产生IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-17没有直接影响(数据未显示)。
接下来对阻断Itgb1、Rps3、Ywhaz表达是否能够增加促炎细胞因子的产生进行检测。与siRNA处理的腹膜巨噬细胞对照组相比，敲除Itgb1、Rps3、Ywhaz的siRNAs增加了腹腔巨噬细胞IL-6和TNF mRNA表达水平(图5e，补充 图8)。此外，用抗Rps3或抗Ywhaz抗体处理后，腹腔巨噬细胞产生的IL-6和TNF增加(图5F)，表明内源性Rps3和Ywhaz的减少促进了促炎细胞因子的产生。
FLSs是RA中参与关节破坏的代表性效应细胞，是侵袭性血管翳的主要组成部分。接下来检测Itgb1、Rps3、Ywhaz在FLSs是否能够产生抗炎活性，结果表明在LPS刺激的小鼠FLSs中，重组蛋白Itgb1、Rps3、Ywhaz呈剂量依赖性抑制IL-6 mRNA和蛋白的表达，（图5G ），FLSs的增殖未产生显著变化（补充 图7）。相反，与腹腔巨噬细胞一样，Itgb1、RPS3、Ywhaz基因的敲除促进了FLSs中IL-6和/或IL-8的表达(图5H，补充 图8)，表明Itgb1、Rps3、Ywhaz的抗炎功能不仅限于巨噬细胞，而且在FLSS中也很明显。
综上所述，这些结果表明Itgb1、Rps3、Ywhaz可能通过抑制RA激活的效应细胞(包括巨噬细胞和FLSs)中促炎细胞因子的产生和/或促进抗炎细胞因子的产生而具有抗炎活性。
图5. 关键调控因子促进抗炎反应。（A-C）Itgb1、Rps3、Ywhaz诱导的IL-6、TNF mRNA和蛋白表达下调；（D）3个调控因子诱导IL-10 mRNA和蛋白表达上调；（E）敲除Itgb1、Rps3、Ywhaz导致IL-6、TNF表达增加；（F）抗Rps3或抗Ywhaz单抗干预6或12小时促进IL-6、TNF的产生；（G）Itgb1、Rps3、Ywhaz重组蛋白分别干预小鼠FLSs 6h后，IL-6 mRNA和蛋白表达下调；（H）qRT-PCR检测Itgb1、Rps3、Ywhaz siRNA转染的FLSs IL-6、IL-8 mRNA水平。
6 Ywhaz作为治疗关节炎的潜在诊断靶点
研究人员的最终目的是确定Itgb1、Rps3、Ywhaz是否可以分别作为预测关节炎消退和抑制关节炎进展的诊断和治疗靶点。因为从中心候选分子中挑选出Itgb1、Rps3、Ywhaz具有分泌特性（补充 图3A），研究人员推测这3种关键调控因子可以在体液(如血清和尿液)中被检测到，同时能反映关节炎的消退状态。为了验证这一假说，研究人员对血清中Itgb1、Rps3、Ywhaz的水平在CIA的高峰和消退阶段是否存在差异进行检测。虽然血清中Itgb1 Rps3水平没有差异(补充 图9)，但血清中Ywhaz水平在消退期明显升高(图6A)，表明它可以作为慢性关节炎解决的替代标志物。这些结果再加上Ywhaz在消退期滑膜以及免疫抑制相关的Tregs和M2巨噬细胞中表达升高的发现，促使研究人员研究Ywhaz是否可以反映关节炎的消退情况。最后，首先将RA患者(n = 65)根据疾病活动度(DAS28-ESR)分为3组(低、中、高活动度)（补充 表9）。然后研究人员比较了三组患者血清和尿液样本中Ywhaz的丰度。预处理前后Ywhaz水平在三组间无显著差异(数据未显示)。然而，当对连续使用抗风湿药物治疗4-6个月后（n=60），尿液中ΔYwhaz水平(治疗前-治疗后Ywhaz水平)在反应良好组(n=23)显著升高，在反应中度组(n=12)无明显变化，在无反应组(n=25)下降(图6B)。然而它在血清中无变化。研究人员发现使用甲氨喋呤、羟基氯喹、来氟米特、他克莫司和包括TNF-阻断剂在内的生物制剂后，各组间Ywhaz表达无差异（数据未展示）。总的来说，这些结果表明Ywhaz代表人类慢性炎症的消退，尿液中Δywhaz的水平可作为反映RA消退的替代指标。
图6. Ywhaz是反映小鼠CIA和人RA消退的分泌型生物标志物。（A）ELISA检测小鼠血清中Ywhaz蛋白在高峰期和消退期的水平；（B）比较抗风湿药物治疗前和治疗4至6个月后Ywhaz蛋白表达。
7 Ywhaz过度表达对CIA具有抑制作用
在这3个关键调控因子中， Ywhaz最能反映小鼠和人慢性炎症的消退，这提示Ywhaz可能是治疗RA的有效靶点。因此，研究人员试图在体内研究过表达Ywhaz是否能改善炎症反应和关节炎的进展。为此，研究人员检测了腺病毒介导的GFP标记的Ywhaz基因(Ad-Ywhaz)对促炎细胞因子的产生和CIA小鼠关节炎进展的影响(图7A)。正如预期的那样，与空腺病毒载体(Ad-Con)对照组相比，GFP标记的Ad-Ywhaz局部转移到关节后，小鼠滑膜组织中Ywhaz的mRNA和蛋白表达水平在第3天(第33天)显著提高。免疫后第1、2、3天(初次免疫后第31、32、33天)，荧光成像和qRT-PCR显示关节GFP荧光和mRNA表达水平明显高于肺和肝脏(图7D，7 E)，实际上，GFP在肝和肺中的表达可以忽略不计 (图7D，7E)。在关节内注射GFP后第1、2和3天(初次免疫后第31、32和33天)，GFP在关节内的荧光和mRNA表达水平也明显高于肺和肝脏(图7D，7E)，但实际上GFP在肝脏和肺中的表达可忽略不计。相比之下，作为对照实验静脉注射Ad-Ywhaz后，肝脏和/或肺的GFP水平明显高于关节 (补充图10)。总而言之，这些数据表明，大量Ad-Ywhaz-GFP积累在注射的关节中，消除了人们对其在关节注射过程中可能溢出或溢出的担忧。
在第33天，小鼠滑膜组织中TNF mRNA表达水平显著下调(P < 0.01)，而Ywhaz mRNA表达水平则显著上调(图7B)。此外，在相同的实验条件下，关节内注射Ad-Ywhaz可抑制LPS或抗CD3+抗CD28抗体刺激的淋巴细胞和脾细胞中IL-6、TNF和/或IL-17的蛋白表达水平(补充 图11)，证实Ywhaz在体内抑制促炎细胞因子的产生。最后，研究人员观察了Ywhaz过度表达的治疗效果。首次免疫CII后第30天和第37天关节内注射两次Ad-Ywhaz(图7A)，与Ad-Con相比(图8A)，Ad-Ywhaz明显抑制了CIA的进展(图8A)。在52天的组织学分析中，研究人员还观察到使用Ad-Ywhaz后小鼠关节的滑膜炎症和关节破坏显著减少(图 8B)。此外，Ywhaz过表达显著(P<0.05)抑制关节组织中IL-6和TNF以及血清中抗CII抗体的水平(图8C 、8D)。在相同条件下，经LPS或抗CD3+抗CD28抗体刺激的淋巴细胞和脾细胞中的IL-6、TNF、IL-17的产生可以因为Ad-Ywhaz而减轻(图8E，8F)。因为Ywhaz是一种分泌蛋白，Ad-Ywhaz可能具有潜在作用。综上所述，这些数据表明Ywhaz过表达具有局部和潜在的全身效应，并可能通过体内促炎细胞因子的产生下调来改善CIA。
综上所述，这些结果证实Ywhaz作为中心分子，在消退相关的分子网络中能够反映慢性炎症消退的动态变化，表明它具有治疗慢性关节炎的巨大潜力。
图7. 向小鼠关节腔内注射GFP标记的Ad-Ywhaz后Ywhaz、GFP的表达。（A）建立CIA小鼠模型和用腺病毒载体治疗小鼠的示意图；（B-C）Ywhaz、Il-6和TNF mRNA表达；(D-E) GFP成像。
图8. Ad-Ywhaz对CIA小鼠的抑制作用。（A）CIA小鼠关节腔内注射Ad-Ywhaz或Ad-Con关节炎评分；（B）Ad-Ywhaz抑制CIA小鼠足部肿胀和关节慢性炎症；（C）Ad-Ywhaz降低CIA小鼠血清中anti-CII Ab的水平；（D）Ad-Ywhaz或Ad-Con治疗52天后CIA小鼠滑膜组织中Ywhaz和促炎细胞因子(Il-6、TNF)的mRNA表达；（E-F）Ad-Ywhaz降低促炎症细胞因子的表达。
结论
识别新的抗炎细胞因子不仅有助于衡量炎性关节炎的消退状态，而且对于了解消退过程的基本分子机制也是至关重要的。通过分析CIA进展过程中滑膜组织的动态基因表达谱，研究人员确定了与CIA消退密切相关的3个关键调控因子Itgb1、Rps3、Ywhaz。基于以上实验结果，证明了Ywhaz在关节炎消退过程中的诊断和治疗意义：(a) CIA消退期滑膜组织Ywhaz表达增加；(b) Ywhaz在T细胞和巨噬细胞，特别是Treg细胞和M2巨噬细胞中显著表达;(c)在培养的脾细胞、巨噬细胞和滑膜成纤维细胞中，Ywhaz过表达和敲除分别激活抗炎和促炎反应；(d) 3种调控因子中Ywhaz在CIA消退期的血清中，以及治疗反应良好的RA患者尿液中表达升高；关节周围注射Ad-Ywhaz可改善CIA。总的来说，通过对滑膜组织进行系统转录组分析，研究人员发现了之前未确认的炎症性关节炎解决的关键调控因子。
在这项研究中，作为炎症消退的关键候选枢纽分子，基于描述DEG消退相关的网络模型在2836个DEG中确定了85个枢纽分子（补充 注释2，图3A）。这85个枢纽分子包括在消退期上调的37个分子，它们可以像3个关键调控因子一样，作为CIA消退的潜在调控因子。为了了解37个枢纽分子的功能特征，研究人员对这些基因进行了GOBP富集分析，发现它们主要与细胞增殖、细胞迁移、蛋白酶稳定、氧化应激和细胞内信号传导的应答有关(尤其是对cAMP和TGF- TGF信号的反应)（补充 图12A）。在此之前，大量的报告已经证实了这些过程与炎症的消退之间相关。例如，TGF-β信号转导、T细胞增殖、中性粒细胞凋亡等都与炎症消退相关。此外，这3个关键调控因子分别参与细胞黏附和迁移(Itgb1)、翻译（Rps3）和细胞内信号转导(Ywhaz)。结合之前的报道，本研究的数据表明37个上调的枢纽分子可作为炎症消退的潜在调控因子。
为了发现可用来预测或诱导RA活动消退的关键调控因子，研究人员通过实验对3种分泌型调控因子（Itgb1、Rps3、Ywhaz）的功能进行了检测。虽然这3种分泌型调控因子的抗炎作用还没有完全被了解，但是之前的一些研究已经表明了它们之间的潜在联系具有抑制慢性炎症的作用。例如，表达在RA患者FLSs细胞质膜上的Itgb1通过诱导Fas介导的细胞凋亡抑制细胞增生。Rps3被几种癌细胞株以同源二聚体的形式分泌，将其转导到皮肤细胞能够通过抑制NF-κB和MAPK活性来改善小鼠的耳部水肿。Ywhaz也可以由单核细胞和巨噬细胞分泌，其抑制会增加鳞状癌细胞产生促炎细胞因子。此外，在腹膜炎、葡萄膜炎和干燥综合征的动物模型中从Ywhaz中提取的分泌肽(PEPITEM)能够抑制CD3+T细胞的跨内皮迁移。与以前的研究结果相比，研究人员的结果通过证明Itgb1、Rps3、Ywhaz的细胞来源和作用靶点，以及Ywhaz的体内调控活性，进一步全面地了解了Itgb1、Rps3、Ywhaz的抗炎作用。
RA治疗中新出现的问题和挑战之一是在体液中鉴定出用于预测疾病状态的新的可替代标志物。前期是通过降低包括ESR和CRP在内的促炎标志物来表征RA的消退，但有时它们不能反映RA的变化，尤其是在患者存在抗-IL-6抗体受体时。此外目前还没有临床实验表明可溶性或抗炎细胞因子可以反映RA患者的预后情况。在这里，本研究验证实验显示在CIA消退期间血清中ywhaz水平升高（图 6A），与治疗前相比，RA治疗后反应良好患者的尿中Ywhaz水平显著升高，而在无反应患者组显著降低(图6B)，虽然尿液比其他体液更稳定，但还不清楚为什么Ywhaz水平的这种变化在尿液中很明显，而在血清中不明显。鉴于Ywhaz主要由Tregs和M2巨噬细胞产生(图 3、4)，Ywhaz水平的增加可能反映了这种抑制性细胞类型的数量增加与慢性关节炎的改善成比例。研究人员推测尿液Ywhaz的变化可以作为替代标志物，与先前已知的生物标志共同为RA消退提供一个独特的预测窗口，需要进一步的大规模研究明确这一问题。
TNF或IL-6的阻断已被有效地应用于RA的治疗。然而，这些药物会增加感染传染病的风险，并且在治疗结束后不太可能恢复免疫耐受。此外，IL-4、IL-10和IL-1等抗炎细胞因子已被认为是潜在的候选标志物，但在临床研究中它们未能治疗RA。因此，除了目前临床使用的抑制促炎反应的药物，如何鉴定出能够增强抗炎和抑炎作用的新的候选药物的需求尚未得到满足。本研究发现为Itgb1、Rps3、Ywhaz通过阻断促炎细胞因子和趋化因子(包括IL-6、TNF和IL-8)的产生而抑制巨噬细胞和滑膜成纤维细胞的效应功能提供了证据。Ywhaz对促炎细胞因子的调节似乎不依赖于PEPITEM肽序列，因为PEPITEM与整个Ywhaz蛋白不同，未能抑制脾细胞和FLSs中IL-6的产生(补充 图13)。此外，关节内Ywhaz基因的过度表达大大减少了CIA的发生，而无论是腹腔注射还是关节内注射PEPITEM 100μg，每周2次，共3周，均无疗效(数据未示出)。Tak-en的研究结果表明，这3种调控因子(尤其是Ywhaz)可单独或与抗炎药联合应用于RA的治疗，以期在促进抗炎的同时诱导体内平衡修复。综上所述，本研究数据表明，这3种关键调控因子(特别是Ywhaz)可以单独或与抗炎药联合使用，以期在促进抗炎的同时，诱导修复体内平衡。
具有抑炎作用的脂质介质，包括脂氧素、溶血素和保护素，已被证明可以抑制促炎细胞的功能。它们由M2巨噬细胞合成和释放，在多种细胞表达，同时中能够从多方面发挥抑炎作用。这些抑炎脂质介质也促进抑制性免疫细胞的功能，增加treg的生成和/或使巨噬细胞向抑炎巨噬细胞极化。与抑炎脂质介质类似，Itgb1、Rps3、Ywhaz在Tregs和M2巨噬细胞中高表达，并被证明直接作用于RA的多种效应细胞，如脾细胞、巨噬细胞和滑膜成纤维细胞(图 5)，进而抑制炎症反应和/或促进抗炎反应。这些数据表明，Itgb1、Rps3、Ywhaz可能与促炎脂质介质结合，可作为类风湿关节炎消退的治疗或诊断的分子标志物(补充 图12B)。需要进一步大规模临床研究来澄清这个问题。
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