科研 | 通过补充肠道微生物群产生的戊酸盐可抑制艰难梭菌的生长
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导 读
艰难梭菌(Clictridium difficile)是一种厌氧，形成孢子的革兰氏阳性细菌，通常在抗生素暴露后引起人结肠的机会性感染。艰难梭菌感染(CDI)可导致腹泻，伪膜性结肠炎，中毒性巨结肠，肠穿孔，多器官衰竭和死亡。最近的一项研究表明，复发性CDI的发生率相对于CDI总体而言不成比例地增加; 因此，对复发性CDI治疗的需求上升。
粪便微生物群移植(FMT)是使用健康供体的粪便替换复发性CDI患者肠道中受损的微生物和生态系统功能。尽管FMT在治疗复发性CDI方面非常有效，但详细的作用机制未知。
由于影响肠道微生物群的组成和功能的因素多种多样，在体内进行机制研究是具有挑战性的。由于与人类研究相关的研究具有很大的挑战性，所以对饮食、肠道微生物群和短链脂肪酸生产的研究通常依赖于体外发酵和动物实验。恒化器研究是对人类和动物研究的一种补充，更容易地确定特定疾病状态或干预措施的作用机制。恒化器模型是模拟人体肠道中的某些空间，时间和环境条件的人工体系，恒化器具有许多优于人类和动物研究的优点，先前的研究已经详细讨论过。恒化器已被用于模拟CDI并探讨几种治疗对艰难梭菌生长和发病机制的影响(例如抗生素，噬菌体和乳铁蛋白)。
论文ID
原名：Inhibiting Growth of Clostridioides difficile by Restoring Valerate, Produced by the Intestinal Microbiota
译名：通过补充肠道微生物群产生的谷氨酸盐可抑制艰难梭菌的生长
期刊：Gastroenterology
IF：20.773
发表时间：2018年
通信作者：Julie A. K. McDonald
通信作者单位：Division of Integrative Systems Medicine and Digestive Disease, Department of Surgery and Cancer
实验设计
实验设计路线图
实验内容
1 恒化培养样品的艰难梭菌TVC和孢子计数
在每个恒化器中加入艰难梭菌孢子后，每隔一天进行艰难梭菌TVC和孢子计数直至实验结束(图1)。结果发现，克林霉素给药期间，艰难梭菌TVC增加(P <.001)。但是，与盐水处理的培养物相比，FMT处理的培养物中艰难梭菌TVC降低94％(P<.025)，艰难梭菌孢子计数降低86％(P<.034)。
图1 在实验过程中，盐水处理的培养物（黑色虚线）和FMT处理的培养物（黑色实线）中的艰难梭菌平均数量。（A）平均艰难梭菌TVC。（B）艰难梭菌孢子平均数量。灰色阴影框表示克林霉素给药期，垂直虚线表示FMT或盐水给药时间。误差线代表平均值±SD（SANTA的* P <.05）。CFU：菌落形成单位
2 通过1H-NMR光谱对Chemostat培养样品进行整体代谢物分析
本文开展了1H-NMR光谱学作为研究恒化器中的样品产生的整体代谢物的光谱图的探索性技术。与稳态期相比，克林霉素给药期间的戊酸盐(P=.004)，丁酸盐(P=.004)和乙酸盐(P=.013)显着降低，5-氨基戊酸(P=.004)，乙醇(P=.021)，琥珀酸(P=.004)和异丁酸(P=.004)显著升高(图2和补充图3)。
在克林霉素给药期结束后，琥珀酸盐，丁酸盐，乙酸盐和异丁酸盐的水平恢复到抗生素前水平，并且不受FMT处理的影响(图2和补充图3)。然而，停止克林霉素给药后，与抗生素处理前的水平相比，戊酸盐(P=.009)仍然显着下降，5-氨基戊酸(P=.009)和乙醇(P=.013)仍然显着增加(图2)，表明停止克林霉素给药后这些代谢物的水平没有恢复。此外，停止克林霉素给药后，与抗生素处理前的水平相比，异戊酸盐降低(P = 4.009)，丙酸盐升高(P = 4.0036)(图2和补充图3)。
但是，与盐水处理组相比，FMT处理后的戊酸盐(P =.032)显着上升，5-氨基戊酸(P =.032)、乙醇(P =.032)丙酸盐(P =.032)和甲醇(P =.039)显着下降(图2)。
图2 克林霉素处理和FMT（盐水处理的培养物，虚线; FMT处理的培养物，实线）后的1H-NMR代谢物发生改变。（A）戊酸盐，（B）5-氨基戊酸，（C）乙醇，（D）琥珀酸盐，（E）丙酸盐和（F）甲醇。阴影灰色框表示克林霉素给药期，垂直虚线表示FMT或盐水给药时间。使用具有Benjamini-Hochberg错误发现率的SANTA来比较稳态培养物与克林霉素处理的培养物，克林霉素处理后培养物的稳态培养物和盐水处理培养物的FMT处理培养物。VA，盐水载体对照; VB，FMT准备。
3 Chemostat培养样品中的胆汁酸超高效液相色谱和MS分析
因为胆汁酸在艰难梭菌的孢子发芽和营养生殖中的重要作用，因此检测了Chemostat培养样品中的胆汁酸的变化。在克林霉素处理期间，共轭初级胆汁酸TCA (P=.004)、肝胆酸(GCA; P=.005)和甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA; P=.005)，非共轭初级胆汁酸胆酸(CA; P=.004)、鹅去氧胆酸(CDCA; P=0.37)，以及非共轭次级胆汁酸牛磺脱氧胆酸(TDCA; P=.045)和甘氨脱氧胆酸(GDCA; P=.004)的水平显著升高(图3和补充图9)。在克林霉素给药期间，次级胆汁酸脱氧胆酸(DCA; P=.006)，石胆酸(LCA; P=.005)和熊去氧胆酸(UDCA; P=.037)显着降低(图3和补充图9)。在克林霉素给药期结束后，这些胆汁酸的水平恢复到稳态水平(克林霉素给药前)，并且不受FMT治疗的影响。
图3.克林霉素处理后胆汁酸的改变与艰难梭菌TVC相关（盐水处理的培养物，虚线; FMT处理的培养物，实线）。（A）TCA，（B）CA，（C）DCA和（D）LCA。阴影灰色框表示克林霉素给药期，垂直虚线表示FMT或盐水给药时间。使用具有Benjamini-Hochberg错误发现率的SANTA将稳态培养物与克林霉素处理的培养物进行比较。VA，盐水载体对照；VB，FMT准备。
4 人体粪样品的气相色谱和质谱分析
为了证实恒化器实验的结果，本文开展了人体粪便样品的气相色谱和质谱分析，粪便样本来源于健康供体、复发性CDI患者供体和FMT后的几个时间点(1，4 和12周；图4)。研究发现，与健康供体相比，复发CDI患者的粪便样本中的戊酸已耗尽(P=.0075)。但是与FMT之前相比，FMT后的CDI患者的戊酸盐显着升高(P =.0007，1, 4和12周)。与FMT后任何时间点收集的样品相比，健康供体的戊酸没有显着差异(所有比较P> .05)。
图4 FMT对健康FMT供体（n=5）和FMT前和FMT后几个时间点（n =16）的复发CDI患者（n=16）粪便中戊酸浓度的影响。Mann-Whitney U检验供体与FMT前，弗里德曼检验FMT前和FMT后。
5 使用戊酸盐和TCA进行艰难梭菌分批培养实验
进行分批培养实验是为了直接研究目标特定代谢物对艰难梭菌孢子萌发和营养生长的影响，并确认恒化器实验的结果。实验表明，在浓度至少为4 mmol/L (P=.008)，2 mmol/L (P=.003)和2 mmol/L (P=.008)时，戊酸分别抑制了艰难梭菌核糖型010、核糖型012和核糖体027的生长(图5)。所有样品中，FMT处理的恒化器培养上清液中的戊酸浓度高于4 mmol/L，而盐水处理的培养物中的戊酸浓度低于2 mmol/L。作为对照，本文测定了戊酸对分离得到的肠道共生菌(其中，B. uniformis和B. vulgatus是2种具有代表性的拟杆菌属物种，C. scindens是代表性的厚壁菌种)的影响。只有含20 mmol/L戊酸盐的肉汤可以抑制拟杆菌(B. uniformis)(P=.026)。在所测试的任何浓度的戊酸盐中，B. vulgatus都没有被抑制，反而含有10 mmol/L (P=.020)或20 mmol/L (P=.019)的戊酸盐的肉汤促进了其生长。在任何测试的戊酸盐浓度下，C. scindens都没有受到抑制(对于所有测试的戊酸盐浓度，P> 0.05)。
图5. 戊酸抑制分批培养液中艰难梭菌的营养生长。将营养细胞接种到含有不同浓度的戊酸盐（0, 1, 2, 3, 4, 5, 10和20 mmol/L）的脑心浸液肉汤中，并在0, 2, 4, 6和8小时的时候分别进行OD600测定。根据戊酸盐的浓度，将OD600的测量值（从指数期的时间点）进行作图。（A）艰难梭菌核糖型010，（B）艰难梭菌核糖型012，（C）艰难梭菌核糖型027，（D）B. uniformis，（E）B. vulgatus，（F）C. scindens。
6 CDI小鼠模型中的甘油三戊酸酯干预研究
接下来，本文在CDI小鼠模型中研究戊酸是否可以抑制艰难梭菌生长(图6A)。为了避免戊酸盐的快速摄取和在胃肠道中获得足够的戊酸的释放，本文以甘油三戊酸酯的形式处理小鼠。感染后一天(在甘油三戊酸酯或PBS处理之前)，每组小鼠粪便中艰难梭菌TVC水平没有显着差异(P=.584)。在感染后1, 2和3天通过灌胃的方式，给小鼠服用甘油三戊酸酯或PBS(每组n =5)。与PBS处理的小鼠相比，甘油三戊酸酯处理的小鼠中的艰难梭菌TVC显着降低(第二天P=.027，第3天P=.007，第4天P=.024；图6B)。与PBS处理的小鼠相比，甘油三戊酸酯处理(3剂)的小鼠每克粪便的艰难梭菌TVC平均减少了95％。在实验过程中，在甘油三戊酸酯处理的小鼠中没有观察到副作用。这些结果证实了本研究中的其他研究结果，并支持戊酸盐在CDI上的治疗用途。
图6.甘油三戊酸酯显着降低CDI小鼠粪便中艰难梭菌TVC。（A）实验设计。在小鼠饮用水中添加头孢哌酮，饮用5天，然后换成无抗生素的高压灭菌水。在第0天，灌胃给予小鼠105CFU的艰难梭菌孢子。在第1, 2和3天，给小鼠喂食甘油三戊酸酯（n=5）或PBS（n=5）。（B）在第1, 2, 3和4天从小鼠粪便中检测艰难梭菌TVC。
结 论
本研究发现戊酸在体外和体内显着抑制艰难梭菌的生长。戊酸盐直接抑制几种艰难梭菌核糖型的营养生长，但对其他共生的肠道细菌的生长影响极小。此外，甘油三戊酸酯显着降低CDI小鼠模型中的艰难梭菌TVC。因为本文提出假设，即维持或恢复CDI患者肠道微生物群中的戊酸水平可以抑制艰难梭菌的营养生长。这种恢复可以通过直接向肠道输入戊酸盐(例如以甘油三戊酸盐的形式)或通过移植能够将戊酸盐前体转化为戊酸盐的细菌来实现。
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