科学前沿|Cell：菌群研究：应聚焦因果和机制
本文由崔祥编译，董小橙、江舜尧编辑。
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学术和商业机构对微生物组的研究热情非常高涨。本篇展望认为，为了实现其潜能，该领域需要关注于建立因果关系和分子机制，尤其是那些数量庞大且易于测量和明确由微生物群驱动的表型。
论文ID
原名：microbiome：focus on causation and mechanism
译名：菌群研究：聚焦因果和机制
期刊：cell
IF：31.398
发表时间：2018年
通信作者： Michael A. Fischbach
通信作者单位：Department of Bioengineering and ChEM-H, Stanford University and Chan Zuckerberg Biohub, Stanford, CA 94305, USA
综述内容
微生物组研究正以飞快的速度产生令人兴奋的结果，其中许多早期的发现是有关联的。在一个新领域，现象的发现往往先于机制，所以对于微生物组研究这一新领域，我们做的正是关注其重要现象的发现，以便我们更好的进行机制的探索。的确，人们普遍认为微生物已经足够成熟成为一门以机制为基础的学科，而且越来越多的研究已经开始，在这个空间里开创了对分子理解的探索。
在工业方面，一批先驱者们正对传染病、癌症免疫疗法和免疫调节等领域的未解现象进行机制理论的探索。然而，重大的失败常常会使人们对可行性产生怀疑。
尽管人们对微生物群体有着浓厚的兴趣，但最有可能产生影响的分子机制的途径仍然是激烈争论的话题。这一观点的中心论点是，学术界和商业界的努力应该聚焦在因果关系和机制上，尤其应重点关注那些数量庞大且易于测量的明确由微生物导致的一些病理现象。作者考察了两个有关微生物菌群机制、小分子产物和免疫调节的两个比较成熟的领域，然后探讨了两个对研究和挖掘这些与微生物相关的病理现象至关重要的的话题：在复杂的混合体和合成生态学中，将单个细菌种类和分子作为一种手段，来研究和开展治疗微生物的手段。
1. 追求因果关系与机制
许多微生物与宿主相互作用的研究都有一种共同的模式：它们从一种表型开始(通常与疾病有关)，并试图了解导致它的微生物群或基因。这类似于正向遗传学，但有三个重要的区别(图1)：表型和基因型的机制不同(宿主和微生物独立)，主要技术是差异序列分析，而不是遗传学，其结果通常是与表型相关的细菌，而不是负责表型的基因。
图1 破译微生物机制的挑战与对策
正向遗传方法取得了显著的成功，可分为三类(所引用的例子都是说明性的，而不是详尽无遗的)：(1) 对导致分类学关联的疾病队列的比较序列分析，(2) 表明一种表型可以在无菌小鼠中移植的研究，(3) 致力于将导致宿主病理问题的菌群缩小到一个或少数几种。面临的两个挑战是：首先，鉴于比较序列分析中存在大量菌株，缩小与一个表型有因果联系的物种的过程可能会遇到随意选取的统计问题。鉴于检验每一种可能的菌株的实际挑战，仅仅相关的菌株往往被认为是因果关系。第二，即使确定了一个有因果关系的菌株，也很难建立与表型的作用机制联系。
相反，一种类似于反向遗传学的方法在微生物种群研究中使用的频率较低。最常见的是两种相关的实验形式：(1)只在单一菌株存在的情况下才用不同群落对小鼠进行定殖，并将其结果进行比较，(2)用野生型和突变型菌株对小鼠进行定殖。虽然它可能会遇到随意选取的问题，反向遗传学的优点在于它是建立因果关系和研究机制的一个更简单的切入点。更复杂的微生物模型、对重要肠道细菌菌株的遗传工具的改进、培养以前未培养的细菌株的方法、在复杂环境中方便定殖的新技术，以及更好的微生物相关疾病动物模型，将更直接加强处理因果关系和机制的方法，无论是正向还是反向。
未来的技术——例如，整个微生物群的等价物——基因敲除和CRISPR屏幕——将模糊正向和反向遗传之间的区别。重要的不是这些方法之间的区别，而是在给定的情况下，它们是否能揭示因果关系和分子机制。在本节的其余部分中，我们考虑了两个可能涉及因果关系和机制的领域：（1）小分子的产生（2）宿主免疫应答的调节。读者可参阅第三个领域成熟的机制研究领域的最新文献：对病原体的定植抗性。然后，我们提出了具有大效应表型的推测可能性，这些异常表型和罕见的人类遗传变异一样，可能具有很大的治疗前景。
2. 小分子的生产和消耗
鉴于小分子在介导信号相互作用方面的突出作用，肠道微生物群产生数十毫升摩尔浓度的分子这一事实特别有趣，一个常见的例子是短链脂肪酸(SCFAs)，它以150-600毫米/天的速度积累，并通过G蛋白偶联受体41和43(GPR41和GPR43)来调节宿主的免疫和代谢系统。另一种是氧化三甲胺(TMAO)，它来源于肠道微生物对胆碱和肉碱的代谢，在血浆中以2-6μM的速度存在。在小鼠疾病模型中，它被认为不仅是心血管疾病的标志，而且本身具有促动脉粥样硬化和血栓前症。尽管对SCFAs和TMAO进行了大量的研究，但微生物产生许多其他小分子，其浓度与临床所用药物的浓度相当。芳香族氨基酸代谢物是常见的，包括色氨酸代谢物吲哚，其在肝脏中转化为硫酸吲哚（IS）(10-130毫克/天)；酪氨酸代谢物对甲酚在宿主内被转化为对甲酚(PC)(20-230毫克/天)；和苯丙氨酸代谢物苯乙酸在宿主与谷氨酰胺结合形成苯乙酰谷氨酰胺(4.5-70毫米/毫米肌酐)，TMAO，IS，和PC在肾功能衰竭患者中累积，这表明，一种微生物靶向疗法以消除它们的产生可能是肾病的一个新的治疗机会。
小分子物质的一个重要来源就是日常的饮食，肠道微生物可以将这些物质转化为具有不同生物活性的各种代谢终产物。例如，色氨酸可以转化为IS、吲哚丙酸、吲哚乙酸和色氨酸。这些代谢物的水平在个体间差异很大，大概反映了他们的肠道群落中代谢基因含量的差异。因此，给出了一种共同的饮食，不同的微生物群可以产生个体间差异很大的代谢产物。这种模式提出了与基础研究和工业同样相关的问题：哪些分子是有益的，哪些是有害的？什么是最佳的肠道代谢产物？在疾病状态下这些代谢产物又会如何变化呢？我们可以利用这些可塑造的肠道菌群产生特定的一些小分子代谢物吗？
3. 调节宿主免疫应答
一些研究表明，微生物直接调节宿主的免疫应答。两个关键的观察结果表明，微生物群的免疫调节作用可能比以前所认识到的要多得多。首先，Littman和他的同事们在经过深入研究的小鼠共生体中发现Th17细胞是响应于丝状菌的诱导而产生的，其拥有表达SFB抗原的T细胞受体（TCR）。虽然以前已知SFB能诱导Th17细胞，但令人吃惊的是，肠道定植菌在不破坏肠道上皮的情况下，能够产生针对肠道定植菌的免疫细胞。最近有关肝螺杆菌(Hh)诱导Hh-特异性调节T细胞的工作得到了发展。Belkaid和同事们进一步证明了这一结果的普遍性，他们表明，CD8+T细胞对皮肤表皮葡萄球菌的反应不仅是高效的，而且可以持续数月，表明“编程”效应是有效和持久的。
这种未预料到的特异性在粘膜免疫反应的共同微生物有深远的影响，并提出了几个关键问题。(1)有多少肠道辅助性物质能诱导自己相应的免疫细胞群？设计好的肠道联合体能作为规划宿主T细胞反应的工具吗？(2)这种现象是否解释了微生物群对抗PD1治疗黑色素瘤和其他癌症疗效的深远影响？(3)决定T细胞命运的微生物群衍生或诱导分子是什么？细胞类型和信号传导途径是什么？(4)如果共同诱导的T细胞表达细菌抗原特异性TCR，它们如何通过交叉反应、接近或其他方式调节对宿主组织的免疫反应？这种抗原特异性反应能否通过在细菌株中表达宿主抗原来重新定向？
一个近期可能实现的目标是使用辅助性或共价衍生分子作为新的免疫治疗的基础。这种方法的一个很大的优点是它的选择性，它可以带来比全身免疫疗法更少的副作用。例如，对局部T细胞反应的精细控制可以增强CD8+细胞对黑色素瘤或结直肠腺癌的检查点阻断，而不会有全身免疫刺激的风险。同样，局部刺激可抑制小肠和大肠(炎症性肠病)或皮肤(牛皮癣)的免疫活动，而不受全身免疫抑制的影响。甚至可以想象设计一个Treg诱导菌株的工程通过表达宿主自身抗原来逆转自身免疫性疾病。
4. 异常微生物群表型
DNA测序对人类医学最直接的好处之一是找出一些基因异常者，这些异常基因隐藏着一种罕见的突变，能够保护人们免受疾病的侵袭。例如，前体蛋白转换酶PCSK9中无意义的突变降低了LDL-c，并对心血管疾病起到了保护作用，Nav1.7功能丧失使人对疼痛不敏感，CCR 5缺乏症可防止艾滋病毒感染，这三种蛋白质都已成为有效的药物靶点，针对每种蛋白质的新疗法现已获得批准或在临床试验中得到批准。
同样的概念是否也适用于微生物群呢？与全基因组和微生物群的关联研究不同，通常会发现一些常见的变异体，其影响很小，其目标是寻找稀有的群落(含有不寻常的细菌或比例不寻常的普通物种)，它们对感兴趣的疾病有很大的保护作用。例如，是否有罕见的人，他们的肠道细菌非常有效地收集卡路里，从而防止代谢性疾病？有没有可能有患克罗恩病的风险等位基因的人，他们的肠道环境能够抑制炎症或阻止不良行为的发生?医院工作者，尽管经常接触金黄色葡萄球菌，由于一种罕见的保护性皮肤菌群，使其没有定植？像这样的表型将是探索机制的绝佳场所，微生物群的可移植性使数百万人有可能获得一个罕见的预防疾病的肠道或皮肤群落。
5. 单个的有机体和分子可以有一个大的影响
一个与宿主相关的由数百个微生物物种、数千个分子组成的复杂群落引发了单个生物体或分子能产生多少差异的问题。大多数与微生物相关的现象是数十个微生物或分子协同作用的结果吗？引起个体病理现象的微生物还能更有针对性吗？
早期的证据表明了另一种情况。对SFB和表皮葡萄球菌的特异性T细胞反应是一个单一细菌如何对宿主产生明显影响的例子，但还有几个值得注意。普鲁士尼茨菌和喙突副鞭毛虫与抑制肠道炎症、特异乳酸菌菌株改变小鼠的行为和认知有关。此外，在自闭症谱系障碍的母体免疫激活模型中，脆弱杆菌还被证明可以对抗小鼠的神经发育和肠道屏障缺陷。尽管不是单个生物体，17种厌氧厚壁菌的混合物能有效诱导调节性T细胞。
虽然这些相互作用尚未从分子机制的层面上被理解，但对于微生物来源的的单个分子信号已有了一定的认识。除了有充分证据证明的SCFAs和TMAO(见上文)之外，多糖A和脆弱杆菌α-半乳糖神经酰胺是分别通过TLR 2和CD1d作用的强效免疫调节剂；赖纳克肽来源的耐热肠毒素通过鸟苷酸环化酶2C诱导胃肠运动;次级胆汁酸,包括脱氧胆酸和熊去氧胆酸,对宿主的代谢和免疫活性以及结肠癌的发生都有广泛的影响。此外，诸如RegIIIg和硝酸盐等个体宿主因素对肠道群落的组成和功能有很大影响，鉴于对微生物衍生的重要代谢物的寻找仍处于初期阶段，这些例子可能是第一个例子。
为了明确这些发现的意义，细胞和发育生物学家一直致力于探索这些单个分子是如何导致当下不断增多的病理现象。哺乳动物是数千种化学物质的复杂混合物，然而信号分子，如5-羟色胺、催产素、鞘氨醇-1-磷酸和雌二醇，在细胞和生理层面都具有强大、明确的活性。我们有充分的理由认为，单个分子的主导活动模式将适用于微生物中的一个重要的分子子集。如果是这样的话，要理解微生物-宿主相互作用的机制并以治疗的方式加以利用，将比目前预期的要容易得多。
6. 发展综合生态学的基础科学
学术和工业微生物群研究的发展驱使人们对微生物群落的机制进行进一步的探索。在学术界，虽然无菌小鼠单殖化实验已经对微生物与宿主的相互作用产生了巨大的机制洞察力，但以简单的形式研究庞大且极尽复杂的群落将会造成大量的生物学信息缺失(例如，浓度为几十毫摩尔的分子池效应的影响，也许几十到几百种不同的免疫调节事件的影响)。在实验中，一个菌株(或者极端是一个菌株中的一个基因)被移除并观察到对宿主的影响，这些实验更有可能经受时间的考验。
在工业方面，粪菌移植(FMT)治疗难辨梭菌感染的效果显著，其极低的急性不良事件发生率和早期良好的植入效果促进了FMT在其他病理现象上的试验。但是，在粪菌移植的推广上存在两个极大的挑战，这两方面都表明粪便作为菌群移植材料需要加以限制。(1)粪便的采集具有局限性且难以规范化的特性。对安全性、重现性和易于制造的需要促使人们将供体粪便转化成确定成分的细菌群落。(2)粪便样品再怎么优化也不能像药物化学和蛋白质工程那样直接改善小分子物质和生物标记物。一个成分明确的菌群可以有助于功能的修复，这对新药的发现至关重要。
学术和工业方面的挑战都可以通过开发新的构建或者人工合成菌落的方法来解决，但因其由数百个菌株组成，十分复杂。虽然有许多实际的挑战需要克服，但移植微生物群落的早期工作已经开始证明这种方法的价值。这样一个系统可以为研究一系列基础科学问题打开大门：在一个由数百个菌株组成的群落中，有多少有意义的菌株-菌株相互作用？什么构成了一个生态位？菌株如何映射到生态位？稳定性的分子相关性是什么？一个群落如何在受到扰动的情况下重新配置？最重要的是，它将使人们能够对微生物群的因果关系和机制进行具有里程碑意义的研究，给这个系统带来了近乎原子化的控制水平，这个系统可以从更多的还原论的研究中获得巨大的好处。
点 评
肠道菌群已经成为国内外研究的热点，学术和商业机构应聚焦于因果与机制研究。分子水平上研究短链脂肪酸等其它分子是揭开因果关系强有力的证据。借助全基因组敲除、CRISPR以及无菌动物模型等手段可揭开因果关系。此外通过发展基础学可以科解决基础研究和工业方面的难题。