编译：傻狍子，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
饮用水中的抗生素抗性基因（ARG）的扩散及向病原微生物的潜在水平转移可能会导致抗生素失效。然而，在饮用水中监测抗菌素耐药性目前还不普遍。ARG的细菌宿主即抗药性细菌（ARB），尤其是饮用水中的小型微生物，可能无法通过膜过滤消毒有效去除，从而对人类健康构成威胁。在本研究中，作者采用基于宏基因组学的方法，对来自中国大陆，香港和新加坡的12个城市的20个家庭饮用水样品中的小尺寸微生物的抗生素抗药性进行了调查。共检测到265种属于17种ARG类型的ARG亚型，其丰度范围在4.0 x10-2至1.0x100拷贝数/细胞之间。多药耐药基因，杆菌肽和氨基糖苷抗性基因在其中占主导地位，并且43种ARG亚型是由小型微生物特异性携带的。宏基因组策略揭示了三种条件致病菌的片段，即产碱假单胞菌、铜绿假单胞菌和戈登分枝杆菌，分别携带mexW、aph(3′)-I和aac(2′)-I。
根据饮用水样品中是否存在ARG，病原体和携带ARG的病原体，将饮用水样品分为三类。这些关于饮用水中小微生物耐药性的新发现表明，有必要对饮用水供应进行更全面的ARGs监测。这些发现，连同本研究提出的观点和战略，可以支持改善饮用水安全的倡议。
原名：New insights into antibiotic resistome in drinking water and management perspectives: A metagenomic based study of small-sized microbes
译名：对饮用水中抗生素耐药性的新见解和管理视角:基于宏基因组的小型微生物研究
期刊：Water Research
IF：7.051
发表时间：2019.1
通讯作者：张彤
本文在12个城市和地区采集了20个家庭水样本，通过超声波处理，将微生物细胞从净化器内的过滤器分离到超纯水中，通过0.2mm的纤维素酯膜进一步过滤，拦截0.2-0.45mm尺寸的微生物进行进一步研究。从每个样本中提取基因组DNA，并构建350bp的文库，每个水样品产生4Gbp的宏基因序列，共产生80Gbp。宏基因组学数据存入NCBI中，登录号SRP139701。在整合了ARDB及CARD的结构化ARG数据库SARG中搜索所有的宏基因组测序数据，并使用自定义脚本将识别到的ARG-like数据自动分类为23个ARG类型和1227个ARG亚型。进一步了比较饮用水中不同微生物群落的ARG图谱，将ARG丰度标准化并表示为每个细胞中的ARG拷贝数，采用R及QIIME对数据进行了具体的分析和绘图。同时，为了鉴定ARG的细菌宿主，对携带ARG的序列（ACC）进行了鉴定和分类注释。使用带有默认参数的IDBA算法组装宏基因组序列，利用Prodigal对组装的序列进行开放阅读框预测。根据结构化的SARG数据库对识别出的ARG-like序列进行分类，提取携带ARG-like开放阅读框的序列。然后将ACC的物种级分类与前人研究中提出的病原学综述表进行比较，以识别携带ARG的病原。最后使用基因组系统发育分析对宏基因组序列进行分类分析，然后从获得的生物分类谱中提取物种分类群和相应的风度，并于先前汇总的病原体清单进行进一步比较，以识别饮用水样品中的小型病原体。
首先，我们基于结构化SARG数据库的宏基因组学技术，分析饮用水中小型微生物的抗药性，并给出了这些微生物通过膜消毒后携带的ARGs的全面谱图，从而通过饮用水对人类健康构成直接威胁。在12个城市采集的20份饮用水样本中，共检测出17个ARG型，包括265种ARG亚型，总丰度范围为4.0x10-2至1.0x100拷贝数/细胞之间（图1，表1）。到目前为止，由于ARG的生物量较低和样本采集的局限性，对其在家庭饮用水/自来水中含量的研究非常有限。在之前有限的研究中，XU等（2016）使用高通量qPCR对自来水中不同的ARG进行了定量，正常的ARG相对丰度为5.75 x10-1到 8.25 x10-1拷贝数/细胞之间，这在我们的检测范围内。
图1饮用水样品中小型微生物中ARG类型的丰度。MLS：大环内酯类、林可酰胺类及链阳菌素。A：最多的8个ARG类型的丰度。该曲线包括零的丰度。B：精氨酸类型和丰度的热图。采样位置缩写列于附表S1中。
表1 饮用水中微生物携带的ARG类型和亚型的分布和事件。
在这些微生物中，多药耐药基因、杆菌肽耐药基因和β-内酰胺耐药基因的丰度最高。此外，在所有样本的小型微生物中，上述三个ARG类型以及对大环内酯类、林可酰胺类及链阳菌素（MLS）、氨基糖苷类、磺胺类和磷霉素具有抗性的基因被检测为通用的ARG类型。在265种ARG亚型中，bacA（杆菌肽）和mexF（多药）占主导地位，它们在饮用水样本中的丰度分别为1.4-2至2.4-1和1.5-3至6.5-2拷贝数/细胞。图2展示了饮用水样品中56个小型微生物携带的ARG亚型的概况，平均丰度为>1.0-3拷贝数/细胞。值得注意的是，所有城市的饮用水样本中普遍存在27个ARG亚型。包括抗杆菌肽(bacA和bcrA)、磷霉素(rosA和rosB)、MLS (macB和macA)、多药(acrB、acrF、adeB、amrB、bpeF、ceoB、emrB、mdtB、mdtC、mdtF、mexB、mexF、mexT、mexW、多药ABC转运蛋白、多药转运蛋白、ompR、oprC)、多菌素(arnA)、磺胺(sul1)和万古霉素(vanR)。其中，17个ARG亚型被定义为所有样本中均存在的泛型ARG亚型(图2)。
图2 饮用水样本中小型微生物中ARG亚型的丰度(平均丰度>1x10-3个拷贝数/细胞)。
此外，通过文献检索获得了4种多用途ARG（bacA，acrB，mexF和sul1）的引物，并随机选择了7个样品以通过qPCR方法进一步验证其普遍性。在样本中检测到的mexF和sul1的丰度与基于宏基因组的方法相似，而bacA和acrB的丰度平均约为前者的100倍。基于宏基因组的ARG检测主要依赖于ARG数据库，因此本研究使用了最完整的ARG数据库SARG v2.0(包含23个ARG类型、1227个ARG亚型和12307个参考序列)。在SARG v2.0数据库中，总共有241个非冗余BacA序列和117个acrB序列。因此，它涵盖了更多的序列多样性，而不仅仅是注释/扩增靶基因的特定序列或区域。一般的ARG类型如杆菌肽，多药，磺胺，β-内酰胺和氨基糖苷，此前有报道称它们在饮用水中相对丰富。从饮用水中分离的菌株也经常被报道对这些抗生素有耐药性。在ARG亚型水平上，bacA、macB、acrB和sul1已在饮用水样品中被检测到，而一些被检测到的ARG亚型，如blaLCR-1、blaLRA-17和blaOXA-142，则是首次在饮用水中被检测到。由于这是第一次关于饮用水中抗生素耐药性的大规模的研究，以确定在饮用水样本中占主导地位的小规模微生物和流行的抗生素耐药性，我们的目的是进一步证明一些被检测到的ARG是否是由饮用水中特定的小型微生物特别携带的，以及这些细菌如何对人类健康构成威胁。
为了揭示饮用水中收集到的小型微生物的特定的ARG模式，我们在相同的样本中比较了小型微生物和大型微生物的ARG图谱。值得注意的是，小型微生物携带的ARGs丰度平均比大型微生物携带的ARGs丰度低7.4% (P < 0.01)。4个ARG型多药耐药基因在小型微生物中显著升高(1.4%、30.5%、23.9%和57.4%) (图3A，柱状图)。并且，饮用水中的小型和大型微生物共有81.1%的ARG多样性，但在265个检测到的ARG亚型中，有43个(16.2%)在大型微生物中未检测到 (图3A，饼状图)，是由小型微生物特异性携带的。上述43种ARG亚型属于4种ARG类型：氨基糖苷类，MLS, β-内酰胺和四环素型。其中共有36个特异的β-内酰胺抗性基因，总丰度为1.1拷贝数/细胞，占β-内酰胺类总丰度的6.1%。曾在大肠杆菌中发现的一种广谱β-内酰胺酶blaTEM-127，在DW1样本(中国大陆黑龙江省)中检测到显著水平，每500个小型微生物中至少有1份blaTEM-127拷贝。为了进一步阐明饮用水样品中不同细菌群落所携带的不同的ARG模式，我们进行了基于小型和大型微生物的ARG图谱的普式分析(图3B)。结果表明，中国大陆的饮用水样本可以单独分布，而且与其他样本相比，山东、上海、甘肃和西藏这些样本之间的相似性要大得多。随后，我们进一步提出了一个问题:“不同样本中小型微生物的抗生素耐药性，或同一样本中小型和大型微生物的抗生素耐药性，哪个差异更显著?”然后使用相关的差异检验来比较这些差异。结果表明，样品之间的r的平均值为0.851，而大小微生物之间的r值为0.931（图4）。因此，尽管发现43种ARG亚型是由小型微生物特异性携带的，但同一水样中小型和大型微生物的耐药性更相似。
图3 饮用水样品中小型和大型微生物ARG谱的比较。MLS：大环内酯类、林可酰胺类及链阳菌素。A：小型和大型微生物ARG丰度和多样性的比较。B：基于小型和大型微生物ARG图谱的饮用水样品分析。
图4 每个样本中小型微生物携带的ARG图谱与相同样本中大型微生物携带的ARG图谱以及其他样本中的ARG图谱的鉴别试验。
我们在饮用水的小尺寸微生物代谢基因组中鉴定出35个携带细菌群的ARG。这些序列包含编码抗氨基糖苷、杆菌素、β内酰胺、多药、利福霉素和磺酰胺的ARG。ACC被标注为蛋白菌(80%)、放线菌(3%)和未分类(17%)的片段(图5)。多药耐药基因(mexF、mexT、mexW)和杆菌耐药基因(bacA)在细菌ACCs中的检出率分别为57%和20%。利用先前概述的病原清单，鉴定出3个ACC为机会致病菌(产碱假单胞菌、铜绿假单胞菌和戈登分歧杆菌)的片段，而在这些携带ARG的病原体片段上未发现致病因子。附表S6提供了3种携带ARG的病原体片段的详细信息，包括NCBI数据库中的丰度和最佳注释。这些携带ARG的病原体片段分别携带mexW、aph(3′)-I和aac(2′)-I，它们分别编码对多药和氨基糖苷类药物的耐药性。在检测到的携带ARG的病原体中，铜绿假单胞菌被认为是一种著名的难以治疗的病原体，可引起严重的疾病和感染。其抗生素耐药性的机制可能对抗生素的开发构成巨大挑战。此外，一种机会性病原体戈登分歧杆菌以前在整个饮用水处理系统中被检测到，最近一项研究揭示了它在饮用水中的出现频率增加。在饮用水中广泛流行的戈登分歧杆菌及其与本研究中鉴定的ARGS的相关性，确定了这种生物是饮用水安全方面的一个必要关注问题。因此，饮用水中抗生素的耐药性，尤其是致病菌的耐药性，可能导致抗生素的失效并对人类造成威胁，值得进一步研究。
图5 在门和物种水平上对携带ARG的序列的注释。
一般认为大肠杆菌和大肠杆菌是饮用水安全的标准病原微生物指标，并设定了0 MPN (CFU)/100 mL的评价标准。然而，由于饮用水生物量低和传统培养方法的局限性，大多数病原体/条件致病菌甚至抗生素耐药病原体都难以检测。在本研究中，ACC的分类注释极大提高了对饮用水中可能存在的ARG宿主(尤其是致病宿主)的识别能力。因此，宏基因组技术是一种很有前途的饮用水安全监测工具，因为它可以对ARG和携带ARG的病原体进行全面、高通量的扫描。这项技术可以进一步为关于ARB和ARG的管理和人类饮用水的安全控制提供参考资料和支持。
4 饮用水中小型病原菌的分布特征
为了进一步阐明饮用水中的小尺寸病原体的分布特征，使用MetaPhlan2软件进行了分类分析。通过对照先前公布的病原体列表，利用检测到的78个细菌的图谱和这些样品的相应丰度，通过与先前公布的病原体列表的比较，检测到五种机会致病菌，正约氏不动杆菌，琼式不动杆菌，大肠杆菌，嗜肺军团菌和产碱假单胞菌。在样品DW1、DW3和DW16中检测到不同的病原物种。在饮用水中，大肠杆菌是小型微生物中最主要的致病菌，平均丰度为1.52%，总检出率为40%。此外，在本研究中，89％的含有病原体的样品中观察到大肠杆菌。基于其在饮用水中的广泛分布及其作为不同病原体的代表，大肠杆菌可被认为是饮用水中小型微生物中最有可能的病原体指示物。DW11中检出的嗜肺军团菌是另一种主要的人类致病菌。这种细菌是军团病的病原体，军团病是一种严重且常致命的肺炎。而饮用水被认为是嗜肺菌感染的重要来源。在美国，每年有56,000-113,000人感染军团菌。然而，由于传统培养方法的局限性和其在饮用水中的出现频率较低，嗜肺菌尚未被纳入日常饮用水安全监测。随着高通量测序和生物信息学分析技术的发展，对监测饮用水中的病原体提出了一种有效的方法。
5 被ARG污染的饮用水样品的分类
为了便于今后对饮用水的耐药性进行监测和管理，我们根据ARG、病原体和携带ARG的病原体的检测结果，将这些饮用水样本分为三组，A-检测出携带ARG的病原，B-检测出ARG和病原，但未检出携带ARG的病原; C-只检测到ARG。根据专性致病菌与机会致病菌的检测，将A组和B组进一步分为(1)和(2)两个亚组。根据检测到的ARGs是否具有可流动性，将C组进一步分组为（1）组和（2）组(图6)。流动的ARG由流动的遗传元件携带，可以在微生物之间进行基因水平的转移，从而对人类健康构成威胁。因此，符合C(2)组标准的饮用水缺乏可移动目标(尽管存在ARG，但就抗菌素耐药性而言，几乎不存在转移到病原体的可能性)。
图6 被ARG污染的饮用水样品的分类
使用上述分类标准及小型和大型微生物中ARG和病原体的发生对本研究使用的饮用水样本进行分类(表2)。携带机会致病菌的水样,DW7和DW8被分为A(2)组，而75%的样本属于B(2)组，因为它们含有ARG和机会性病原体,但没有携带ARG的病原体。样品DW14、DW15、DW18、DW20中的小型微生物属于C组，然而由于在这些样本中发现了ARGs和机会致病菌，因此将其重新归类为B (2) 组。这一发现表明，通过0.45毫米的膜过滤可以有效地去除这四种饮用水样本中的病原体。此外，本研究中只有15%的样本被归为C组(未检出病原体)。在这项研究中，C(2)组的频率较低（<15%），因此应该对饮用水进行ARG及病原体的检测。本研究基于ARG、病原体和携带ARG的病原体进行研究，反映了抗生素耐药性对公共卫生的潜在风险，可为今后的ARG研究和饮用水管理提供参考和指导。之前关于流动ARG对人类健康风险的频繁报道引起了广泛关注。但是，缺少移动ARG相关的数据库。这个课题对其进行了进一步的研究，并将有利于其他与人类相关的环境，如游泳池和食品安全。此外，还需要对饮用水中存在的ARG、病原体和携带ARG的病原体进行剂量和时间相关的健康风险评估，进一步量化和具体化分类体系，以提高饮用水安全。
表2 基于ARG、病原体和携带ARG病原体的饮用水样品分类。
本研究首次揭示了饮用水中小型微生物对抗生素的耐药性所带来的潜在公共卫生风险。这些小型微生物有小概率会在传统的饮用水处理工艺和进一步涉及过滤膜(尤其是微滤膜)的消毒工艺下停留在自来水中，从而加剧了摄入人体病原体和向人体水平基因转移的风险。为应对小型微生物耐药性带来的挑战，提高饮用水安全，我们提出了以下解决方案和策略:。应当推广膜过滤处理，特别是传统饮用水处理工艺后的水应进一步通过超滤膜(孔径<0.1 mm)处理，以去除饮用水中残留的ARB和ARG。饮用水处理工艺相对较差的国家和地区，以及将自来水直接作为饮用水来源的国家(如美国、新加坡)，应推广膜式饮用水过滤处理。此外，在一些国家和地区，自来水在饮用之前是煮沸的。虽然煮沸确实可以防止饮用水中的微生物引起的感染风险，但是剩余的未被破坏的ARGDNA仍然可以水平转移到病原体上，从而对人类健康构成威胁。（2）ARB和ARG指标应参与饮用水质量和安全性评估饮用水安全已经对公共卫生构成挑战。因此为了控制和预防抗生素失效和ARG向人类病原体的水平转移，ARB和ARG指标应应用于饮用水质量控制上。该指标可从以下3个方面(研究人员-公众-政府)进行规范和标准实施：1)对饮用水中细菌(特别是非致病菌)的ARG及宿主间的水平转移进行更多的研究和评估，2)提高公民对ARG对公共卫生的风险的认识，3)通过政府法律法规进行支持和推广。图7给出了控制饮用水中ARGs和ARB丰度的解决方案和策略，为进一步控制和管理这些指标提供参考和支持。今后有必要继续对饮用水系统中ARG和病原体进行研究，如剂量和持续时间依赖的健康风险评估和消毒技术的改进等。包括研究人员，政府和公众在内的所有有关方面应作出更多努力，以促进可持续管理和保证饮用水安全
图7 为减少对公众健康的潜在风险，对控制饮用水中ARG和ARB含量的解决方案和策略
本研究利用大规模的宏基因组数据分析，为研究饮用水中小型微生物的抗生素耐药性提供了新的思路。本研究共检出属于17个ARG类型的265个ARG亚型，丰度范围从4.0x10-2至1.0x100拷贝数/细胞之间。值得注意的是，编码耐多药、杆菌肽和氨基糖苷的ARG在小型微生物中占主导地位，占携带所有ARG亚型的16.2%。此外，饮用水中小型微生物携带的优势ARG的发生率也通过qPCR方法进行了验证。对于未来不同环境样品中的ARG研究，需要结合高序列多样性强度的宏基因组学方法和低检测限的传统方法(如qPCR)来解决抗菌素耐药性问题。值得注意的是，持续更新ARG数据库不仅有助于全面分析抗生素耐药性，而且有助于为ARG检测设计引物(PCR、qPCR、epic-PCR等)。进一步的相关性分析表明，同一水样中小型和大型微生物的耐药性更相似。产碱假单胞菌、铜绿假单胞菌和戈登分歧杆菌的片段分别携带mexW、aph(3′)-I和aac(2′)-I。基于上述发现，进一步根据ARG、病原体和携带ARG的病原体的存在将样本分为三组，并提出了解决方案和策略，为饮用水抗生素耐药性的控制和管理提供进一步的参考和指导。即：1)膜过滤处理；2)建立包括研究人员、公众和政府在内的饮用水ARG和ARB的监测标准。本文提出的调查结果和将有助于促进在供水当局和政府在议程范围内对饮用水中抗菌素耐药性进行全球监测和风险评估。这些举措将减轻由饮用水传播的潜在耐抗生素病原体感染及抗生素失效对公共卫生造成的威胁。本文采用基于宏基因组学的方法，对来自饮用水样品中的小尺寸微生物的抗生素抗药性进行了调查。并根据饮用水样品中是否存在ARG、病原体和携带ARG的病原体，将饮用水样品进行了分类。本文揭示了饮用水中的小型微生物的特异性及分布特征。这些关于饮用水中小微生物耐药性的新发现表明，有必要对饮用水供应进行更全面的ARGs监测。在最后，本文给出了控制饮用水中ARGs和ARB丰度的解决方案和策略，为进一步控制和管理这些指标提供参考和支持。
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